瘧疾檢驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)課件

●分子生物學(xué)、血清學(xué)技術(shù)發(fā)展迅猛,但是確診瘧疾的“金標(biāo)準(zhǔn)”

仍然是血液顯微鏡檢查●顯微鏡檢查是唯一可鑒別4種瘧原蟲(chóng)的方法●厚薄血涂片的檢查仍被認(rèn)為是不可替代的瘧疾診斷的金標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)厚薄血膜的制作

血片制作在制作血片前，首先要核對(duì)患者的姓名、年齡和住址取血部位和血量采血部位和取血方法：耳垂或無(wú)名指，通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無(wú)名指指尖，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過(guò)深或過(guò)淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒米大小。厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜。薄血膜再取一小滴血.將血置于第一張玻片離厚血膜適當(dāng)遠(yuǎn)的地方.將采血玻片(推片)的邊緣緊貼載玻片使血液沿邊緣散開(kāi)(如圖示).正確的推片姿勢(shì)標(biāo)準(zhǔn)的瘧疾厚薄血膜片位置各種不同的瘧疾血片涂制法：標(biāo)準(zhǔn)血片門(mén)診發(fā)熱病人血片居民普查血片厚薄血膜的標(biāo)準(zhǔn)

●厚血膜血量適宜，不宜過(guò)多或過(guò)少

●薄血膜平整,無(wú)皺折和空泡.紅細(xì)胞單層排列血片染色

兩種染色方法:●吉氏染色法●瑞氏染色法

常用吉氏染色法吉氏染液(原液)的配置

吉氏染粉(AzureBtype)5g甘油(純)250ml甲醇

(純)250ml吉氏粉放入研缽中，加少量甘油充分研磨,

然后邊加邊磨，直至甘油加完，將研磨的染液倒入棕色瓶中，在研缽中加入少許甲醇清洗研缽，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反復(fù)數(shù)次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，將染液充分搖勻，置于室內(nèi)，每天晃動(dòng)數(shù)分鐘，存放一周后經(jīng)過(guò)濾即可使用。保存時(shí)間越長(zhǎng)染色效果越好。整個(gè)染色液配制時(shí)間不能少于5個(gè)小時(shí)稀釋吉氏原液●原液需經(jīng)pH7.0鹽酸緩沖液（PBS）或凈水稀釋后，方可用于厚薄血片染色。

●吸取母液時(shí)，不要晃動(dòng)瓶子,以免沉淀物泛起影響染色效果.操作1（快染）

配制5%染液，（每張血片約需染液2ml）：量筒內(nèi)量2ml緩沖液或凈水，直接滴加吉氏原液7滴，混勻，滴入待染標(biāo)本的厚薄血膜上，染色10min，清水細(xì)緩沖洗，晾干鏡檢。操作2(慢染)在染色量筒內(nèi)量2ml蒸餾水或凈水，再滴加吉氏原液4滴，混勻，滴入待染標(biāo)本上，染色30~40min。清水細(xì)緩沖洗，晾干鏡檢。吉氏染液濃度門(mén)診染色將已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀釋液（3毫升吉氏原液加緩沖液或凈水97毫升，混勻）浸沒(méi)血片，同時(shí)對(duì)厚薄血膜染色30min（根據(jù)當(dāng)?shù)貙?shí)際情況，酌情增減染色時(shí)間和濃度），然后用清水輕輕將染液漂洗干凈，將血片標(biāo)本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包裝，鏡檢。成批血片染色質(zhì)量好的染色:

核呈紅色,胞漿呈藍(lán)色

如果血片偏紅,說(shuō)明染液偏酸性如果血片偏藍(lán),說(shuō)明染液偏鹼性外觀吉氏染色血片染色過(guò)程將血片平置于染色板上。用吸管吸取已稀釋的吉氏液約2ml于厚薄血膜上，染色10min。用清水細(xì)緩沖去染液。置玻片于插板上，自然晾干。血片干燥后,用甲醇固定薄血膜。血片制作與染色注意事項(xiàng)

●使用前載玻片一定要清潔，不然會(huì)影響血片制作和鏡檢結(jié)果．●厚血膜干燥時(shí)不要加熱，加熱會(huì)使原蟲(chóng)變形，影響鏡檢結(jié)果．●配置母液時(shí)過(guò)濾可除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量．●固定薄血膜時(shí)不要將甲醇觸碰到厚血膜●沖洗染液時(shí)，不要沖走厚血膜。原蟲(chóng)密度計(jì)算估計(jì)瘧原蟲(chóng)感染程度有三種方法：●半定量計(jì)數(shù)法檢查厚血膜●白細(xì)胞原蟲(chóng)密度計(jì)數(shù)法檢查厚血膜●紅細(xì)胞感染率計(jì)算法檢查薄血膜用厚血膜每個(gè)視野中所觀察到瘧原蟲(chóng)的平均數(shù)粗略地估計(jì)出瘧原蟲(chóng)密度。這種方法簡(jiǎn)便，缺點(diǎn)是計(jì)數(shù)的瘧原蟲(chóng)數(shù)受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。國(guó)內(nèi)常用。此方法將密度分為6級(jí)：1.全厚血膜查見(jiàn)瘧原蟲(chóng)數(shù)在10個(gè)以內(nèi)，記錄實(shí)際數(shù)字2.全厚血膜查見(jiàn)瘧原蟲(chóng)數(shù)在10個(gè)以上，但平均每個(gè)視野不到1個(gè)蟲(chóng)，記錄“少”3.平均每個(gè)視野1~5個(gè)蟲(chóng)，記錄“＋”4.平均每個(gè)視野6~10個(gè)蟲(chóng)，記錄“++”5.平均每個(gè)視野11~100個(gè)蟲(chóng)，記錄“+++”6.平均每個(gè)視野100個(gè)蟲(chóng)以上，記錄“++++”。半定量計(jì)數(shù)法白細(xì)胞瘧原蟲(chóng)密度計(jì)數(shù)法（WHO推薦）白細(xì)胞瘧原蟲(chóng)密度計(jì)數(shù)法重要性●用于瘧疾研究●用于臨床診斷●用于抗瘧后瘧疾考核●在厚血膜，按要求選擇視野，計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞中的瘧原蟲(chóng)數(shù)（可分有性體和無(wú)性體），如果原蟲(chóng)密度較低，可增加白細(xì)胞計(jì)數(shù)（500~1000個(gè)）?！癜准?xì)胞瘧原蟲(chóng)計(jì)算公式：瘧原蟲(chóng)數(shù)×患者每微升血的白細(xì)胞數(shù)÷計(jì)數(shù)的白細(xì)胞數(shù)=瘧原蟲(chóng)數(shù)/μl血?！袢绻恢颊叩陌准?xì)胞數(shù)，則每微升血以8000個(gè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn))。白細(xì)胞瘧原蟲(chóng)密度計(jì)數(shù)法（WHO推薦）白細(xì)胞瘧原蟲(chóng)計(jì)數(shù)法舉例●假設(shè)計(jì)數(shù)200WBC中有35個(gè)瘧原蟲(chóng)，在不知患者白細(xì)胞數(shù)的情況下，以每微升血8000個(gè)白細(xì)胞為數(shù),由此計(jì)算出每微升血液瘧原蟲(chóng)密度為：35（原蟲(chóng)數(shù)）x8000÷200（白細(xì)胞數(shù)）=1400/μl答：該患者原蟲(chóng)密度為1400/μl。薄血膜不同區(qū)域的紅細(xì)胞瘧原蟲(chóng)感染率有較大差別，通常血膜后端和邊緣部瘧原蟲(chóng)密度常比前半部或中央部高，所以，鏡檢時(shí)不宜只檢查一個(gè)角落，應(yīng)順玻片的橫軸檢查。鏡檢時(shí)，應(yīng)當(dāng)記錄下所觀察到的各種瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)期，不要籠統(tǒng)地記錄為Pv或Pf。紅細(xì)胞感染率計(jì)算法（薄血膜）1.按以下公式計(jì)算：紅細(xì)胞原蟲(chóng)感染率（%）=瘧原蟲(chóng)數(shù)X100÷計(jì)數(shù)的紅細(xì)胞數(shù)2.顯微鏡下選擇紅細(xì)胞排列整齊密集，無(wú)重迭的視野（300-500紅細(xì)胞/視野）3.按一定順序移動(dòng)血片記數(shù)紅細(xì)胞的同時(shí)，記錄瘧原蟲(chóng)數(shù)4.如果能見(jiàn)到瘧原蟲(chóng)，但是記數(shù)5000～10000個(gè)紅細(xì)胞時(shí)卻沒(méi)有感染紅細(xì)胞，那么設(shè)定感染率為＜１％

紅細(xì)胞感染率計(jì)算法（薄血膜）如何確定瘧原蟲(chóng)血片為陰性●檢查全部厚血膜未查見(jiàn)瘧原蟲(chóng)●

最少檢查100個(gè)厚血膜油鏡視野未查見(jiàn)瘧原蟲(chóng)人類(lèi)四種瘧原蟲(chóng)的

基本特征感染人的瘧原蟲(chóng)有四種:

惡性瘧原蟲(chóng)P.falciparum

間日瘧原蟲(chóng)P.vivax三日瘧原蟲(chóng)P.malariae

卵形瘧原蟲(chóng)P.ovale

惡性瘧

P.falciparum

●

四種瘧原蟲(chóng)中致病力最強(qiáng)●

無(wú)免疫力者感染后出現(xiàn)急性癥狀,不及時(shí)治療可危及生命●

在我國(guó)主要流行云南省和海南省

間日瘧

P.vivax

●間日瘧原蟲(chóng)分布于我國(guó)大部分地區(qū)，主要是中部地區(qū)●引起間日瘧,病程呈良性,但有復(fù)發(fā)

三日瘧P.malariae

●三日瘧在我國(guó)已基本消滅●主要發(fā)生在晚秋及初冬,無(wú)復(fù)發(fā)卵形瘧P.ovale●又稱蛋形瘧原蟲(chóng),在我國(guó)已基本消滅●引起癥狀與間日瘧相似,但很少?gòu)?fù)發(fā)四種瘧原蟲(chóng)的

診斷要點(diǎn)

環(huán)狀體釬細(xì),紅細(xì)胞不漲大一個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)可有幾個(gè)環(huán)狀體環(huán)狀體內(nèi)可有2個(gè)核

環(huán)狀體可貼在紅細(xì)胞邊緣

血片中沒(méi)有其他發(fā)育期滋養(yǎng)體配子體呈新月形或臘腸形可出現(xiàn)茂氏點(diǎn)惡性瘧（P.falciparum）鑒定要點(diǎn)紅細(xì)胞通常漲大薛氏點(diǎn)明顯成熟環(huán)狀體粗大滋養(yǎng)體有阿米巴樣偽足可見(jiàn)不同發(fā)育期的原蟲(chóng)

間日瘧（P.vivax）鑒定要點(diǎn)環(huán)狀體可呈方形帶狀形是特點(diǎn)成熟滋養(yǎng)體呈菊花狀,內(nèi)含6～12個(gè)裂殖子紅細(xì)胞不漲大，略縮小有時(shí)有西門(mén)氏點(diǎn)

三日瘧（P.malariae）診斷要點(diǎn)卵形瘧（P.ovale）診斷要點(diǎn)紅細(xì)胞略漲大或不變大

紅細(xì)胞邊緣呈車(chē)輪狀環(huán)狀體有時(shí)呈現(xiàn)魚(yú)眼狀薛氏點(diǎn)明顯成熟滋養(yǎng)體類(lèi)似三日瘧原蟲(chóng),但更粗大原蟲(chóng)呈卵圓形

薄血膜中瘧原蟲(chóng)寄生時(shí)

紅細(xì)胞的變化間日瘧原蟲(chóng)三日瘧原蟲(chóng)惡性瘧原蟲(chóng)卵形瘧原蟲(chóng)漲大,色淺淡,略變形可見(jiàn)薛氏點(diǎn)(除早期環(huán)狀體時(shí))多重感染少見(jiàn)瘧色素黃褐色,散在,呈小桿狀正常,或略小正常染色時(shí)點(diǎn)彩不明顯多重感染少見(jiàn)色素見(jiàn)于早期,黑色顆粒狀,多見(jiàn)于細(xì)胞周?chē)４笮〕Ｒ?jiàn)多重感染一些細(xì)胞呈黃色邊緣較厚過(guò)度染色時(shí)茂氏點(diǎn)明顯瘧色素顆粒較粗新月形配子體外紅細(xì)胞膜見(jiàn)不到感染紅細(xì)胞略漲大或不變大

通常呈卵圓形感染紅細(xì)胞邊緣破碎狀薛氏點(diǎn)明顯瘧色素棕黃色,類(lèi)似間日瘧原蟲(chóng)種周?chē)邪l(fā)育階段紅細(xì)胞形態(tài)瘧原蟲(chóng)形態(tài)大小點(diǎn)彩胞漿瘧色素裂殖子數(shù)惡性瘧原蟲(chóng)環(huán)狀體配子體正常常見(jiàn)茂氏點(diǎn)環(huán)狀體釬細(xì)，常見(jiàn)２個(gè)核粗黑，配子體中明顯16-32

間日瘧原蟲(chóng)各期滋養(yǎng)體裂殖體和配子體漲大,可達(dá)正常的1.5-2倍薛氏點(diǎn)可出現(xiàn)阿米巴樣滋養(yǎng)體，淺藍(lán)色，活潑金棕色不明顯12-24

卵形瘧原蟲(chóng)各期滋養(yǎng)體裂殖體漲大,可達(dá)正常的

1.25-1.5倍薛氏點(diǎn)可出現(xiàn)卵圓形滋養(yǎng)體，藍(lán)色較深，核較大深棕色明顯4-12三日瘧原蟲(chóng)各期滋養(yǎng)體裂殖體和配子體正常西門(mén)氏點(diǎn)少見(jiàn)圓形，藍(lán)色深，核緊縮，滋養(yǎng)體帶狀深棕色，粗明顯6-12呈菊花狀鏡檢示教以下血片采自現(xiàn)癥病例Thisisathinfilmfroma27yearoldfemalebackpacker,witharecenthistoryoftrekkingthroughNorthernThailandandhighfever.

AtypicalPlasmodiumfalciparumpresentation.●Numerousfineringforms●Doublechromatindots●Marginalforms●RedcellsarenotenlargedAthinfilmfroma22yearoldmaleholidayinginLombok(Indonesia)onemonthpreviously.Intermittentfeverssincereturning.AtypicalPlasmodiumvivaxpresentation●Salientfeaturesare:●Developingandthick(signet)ringforms●EnlargedredcellsRecenttravelinAfrica.Pyrexiaofunknownorigin.

AtypicalPlasmodiumovalepresentation●Developingformofplasmodium●Comet-like"redcells●EnlargedredcellFemalepatient,arrivedfromBraziltwoweekspreviously.Flulikesymptomssincearrival.AtypicalPlasmodiummalariaepresentation●Broadbandformofplasmodium●RedcellsnotenlargedThisisathickfilmpreparedfroma32yearoldmalerecentlyreturnedfromVietnam.NumerousringformofPlasmodiumcanbeseen(asindicatedbythearrows).Notesizeofneutrophils(forcomparison).TheonlydefinitivediagnosisthatcanbemadefromthisfilmisthatMalariaispresent.Thinfilmswouldhavetobeexaminedforspeciesidentification.讀片練習(xí)2.Intermittentfever;arrivedfromIndia2monthsago.3.HistoryofroundtheworldsafariincludingS.America,AsiaandAfrica.Generalmalaise.4.Unspecifiedoverseastravel.Presentedwithtemperature38.4C5.Malerecentlyreturnedto