紫外分光光度法的應(yīng)用

關(guān)于紫外分光光度法的應(yīng)用第1頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收●物質(zhì)的顏色由物質(zhì)與光的相互作用方式?jīng)Q定?！袢搜勰芨杏X(jué)到的光稱可見光，波長(zhǎng)范圍是：400~760nm?！褡尠坠馔ㄟ^(guò)棱鏡，能色散出紅、橙、黃、綠、藍(lán)、紫等各色光?！駟紊猓?jiǎn)我徊ㄩL(zhǎng)的光●復(fù)合光：由不同波長(zhǎng)的光組合而成的光，如白光。●光的互補(bǔ)：若兩種不同顏色的單色光按一定比例混合得到白光，

稱這兩種單色光為互補(bǔ)色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補(bǔ)。第2頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三物質(zhì)的顏色：是由于物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光具有選擇性吸收而產(chǎn)生。

即物質(zhì)的顏色是它所吸收光的互補(bǔ)色。無(wú)色溶液：透過(guò)所有顏色的光有色溶液：透過(guò)光的顏色黑色：吸收所有顏色的光白色：反射所有顏色的光物質(zhì)的本色第3頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三完全吸收完全透過(guò)吸收黃光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光藍(lán)光無(wú)色黑色物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系第4頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三

基于物質(zhì)吸收紫外或可見光引起分子中價(jià)電子躍遷、產(chǎn)生分子吸收光譜與物質(zhì)組分之間的關(guān)系建立起來(lái)的分析方法，稱為紫外可見分光光度法（UV-vis）。二、紫外-可見分光光度法（1）靈敏度高，可測(cè)到10-7g/ml。（2）準(zhǔn)確度好，相對(duì)誤差為1%-5%，滿足微量組分測(cè)定要求。（3）選擇性好，多種組分共存，無(wú)需分離直接測(cè)定某物質(zhì)。（4）操作簡(jiǎn)便、快速、選擇性好、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、便宜。（5）應(yīng)用廣泛，無(wú)機(jī)、有機(jī)物均可測(cè)定。第5頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三紫外-可見分光光度法的基本原理一、透光率（透光度）和吸收度①透光率T定義：T取值為0.0%~100.0%T=0.0%：光全吸收T=100.0%：光全透過(guò)②吸光度（吸收度）AT=ItI0×100%顯然，T↑，溶液吸收度↓；T↓，溶液吸收度↑。即透光率T反映溶液對(duì)光吸收程度，通常用1/T反映吸光度。定義：A=lg1T=-lgT=lgI0ItA=-lgT,T=10-AtI0=It+Ia+Ir吸收光反射光透過(guò)光Ia③T與A關(guān)系：IrA∝1/T，T=0，A=∞，T=100%，A=0第6頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、光的吸收定律朗伯(Lambert)和比爾(Beer)分別于1760年和1852年研究吸光度Ａ與溶液厚度Ｌ和其濃度Ｃ的定量關(guān)系：朗伯定律：A=k1×L比爾定律：A=k1×CA=kCL

一束平行單色光通過(guò)一均勻、非散射的吸光物質(zhì)溶液時(shí)，在入射光的波長(zhǎng)、強(qiáng)度以及溶液溫度等保持不變時(shí)，該溶液的吸光度A與其濃度C及液層厚度L的乘積成正比。①入射光為單色光，適用于可見、紅外、紫外光。②均勻、無(wú)散射溶液、固體、氣體。③吸光度A具有加和性。Aa+b+c=Aa+Ab+Ac

注意!適用范圍朗伯-比爾定律:L→2L時(shí)，A、T→？

2AA=-lgT,T=10-A=10-kcL吸光系數(shù)濃度液層厚度T2第7頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、吸光系數(shù)1、摩爾吸光系數(shù)或Em：

在一定λ下，c=1mol/L，L=1cm時(shí)的吸光度。單位：L/(mol.cm)（1）一定條件下是一個(gè)特征常數(shù)。（2）在溫度和波長(zhǎng)等條件一定時(shí)，ε僅與物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測(cè)物濃度c和液層厚度L無(wú)關(guān)；（3）定性和定量分析依據(jù)：同一物質(zhì)在不同波長(zhǎng)時(shí)ε值不同。不同物質(zhì)在同一波長(zhǎng)時(shí)ε值不同。

εmax表明了該物質(zhì)在最大吸收波長(zhǎng)λmax處的最大吸光能力。

4、吸光系數(shù)的意義:2、百分吸光系數(shù)/比吸光系數(shù)：3、兩者關(guān)系:A=kcLk=A/cL

一定λ下,c=1%(W/V)，L=1cm時(shí)的吸光度。單位：100ml/g.cm1g/100ml第8頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三1．定義：以A為縱坐標(biāo)，λ為橫坐標(biāo)，繪制的λ~A曲線。四、吸收光譜（吸收曲線）2．吸收光譜術(shù)語(yǔ)：①吸收峰→λmax,②吸收谷→λmin③肩峰→λsh,④末端吸收⑤強(qiáng)帶：

max>104，弱帶：

max<103特征值第9頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三吸收光譜

特征值：

λmax

λmin

λsh

●同一物質(zhì)的吸收光譜特征值相同,(每一波長(zhǎng)處吸光系數(shù)相同)。同一物質(zhì)相同濃度的吸收曲線重合。●同一物質(zhì)不同濃度，其吸收曲線形狀相似,λmax相同。（定量）●不同物質(zhì)相同濃度，其吸收曲線形狀,λmax不同。（定性）定性、定量分析：在吸收曲線λmax處測(cè)吸光度A。第10頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三吸收曲線的討論：（1）同一種物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸光度不同。吸光度最大處對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)λmax（2）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似λmax不變。而對(duì)于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。（3）③吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。（4）不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長(zhǎng)下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。（5）在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測(cè)定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長(zhǎng)的重要依據(jù)。第11頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三五、偏離光的吸收定律原因朗伯-比爾定律：A=kCL依據(jù)Beer定律，A與C關(guān)系應(yīng)為經(jīng)過(guò)原點(diǎn)的直線（一）化學(xué)因素（二）光學(xué)因素

偏離Beer定律的主要因素表現(xiàn)為以下兩個(gè)方面：第12頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三該定律適用于稀溶液，溶質(zhì)的離解、締合、互變異構(gòu)及化學(xué)變化也會(huì)引起偏離。尤其濃度過(guò)高(>0.01mol/L)會(huì)使C與A關(guān)系偏離定律：①粒子相互作用加強(qiáng)，吸光能力改變。②溶液對(duì)光的折射率顯著改變。故：朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。

溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學(xué)平衡時(shí)。使吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。

例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：

CrO42-＋2H＋

=Cr2O72-＋H2O溶液中CrO42-、Cr2O72-的顏色不同，吸光性質(zhì)也不相同。故此時(shí)溶液pH對(duì)測(cè)定有重要影響。（一）化學(xué)因素朗—比耳定律假定所有的吸光質(zhì)點(diǎn)之間不發(fā)生相互作用；第13頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三（二）光學(xué)因素1．非單色光的影響：入射光為單色光是應(yīng)用該定律的重要前提：2．雜散光的影響：儀器本身缺陷；光學(xué)元件污染造成。3．反射和散色光的影響：散射和反射使T↓，A↑，吸收光譜變形。

通?？捎每瞻讓?duì)比校正消除。4．非平行光的影響：使光程↑，A↑，吸收光譜變形。第14頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三0.575紫外-可見分光光度計(jì)依據(jù)朗伯-比爾定律，測(cè)定待測(cè)液吸光度A的儀器。（選擇不同波長(zhǎng)單色光λ、濃度）光源單色器吸收池檢測(cè)器信號(hào)處理及顯示分光光度計(jì)外觀分光光度原理圖:第15頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、主要部件1.光源：2.單色器：包括狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件鎢燈或鹵鎢燈氫燈或氘燈—可見光源350~1000nm—紫外光源200~360nm色散元件棱鏡光柵對(duì)不同波長(zhǎng)的光折射率不同衍射和干涉,不同波長(zhǎng)的投射方向不同玻璃棱鏡:適用于可見區(qū)石英棱鏡:適用于紫外區(qū)高度拋光的玻璃上刻有等寬、等距平行條痕狹縫：進(jìn)出光狹縫。準(zhǔn)直鏡：復(fù)合光→平行光→色散后→聚集狹縫最佳寬度:減小狹縫寬度而溶液吸光度不變。3.吸收池：比色皿、比色杯，裝樣品溶液。有玻璃、石英杯兩種4.檢測(cè)器：光→電，光電池(硒,硅)，光電管(紅,紫)，光電倍增管。5.信號(hào)處理顯示器：放大較弱的電信號(hào)，并在檢流計(jì)上顯示出來(lái)。第16頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三比色皿：玻璃VS石英杯適用的波長(zhǎng)范圍不一樣石英的范圍更廣,波長(zhǎng)最小可以到達(dá)210nm,可以用在紫外光程,一般測(cè)核酸和蛋白都用石英比色皿,基本上測(cè)什么試劑都可以,但價(jià)格高,一般一個(gè)都要在幾百塊人民幣玻璃的局限性大一些,主要用于可見光程,相對(duì)便宜現(xiàn)在市場(chǎng)上塑料比色皿也在流行起來(lái),但主要還是歐美地區(qū)使用的最多,特點(diǎn)是價(jià)格便宜,不怕摔,可以一次性試用,省時(shí)省力,也更安全,也分不同材質(zhì),但波長(zhǎng)范圍仍然還是比石英比色皿小一些光學(xué)玻璃適用透過(guò)率：320nm-2500nm紫外石英適用透過(guò)率：190nm-2500nm第17頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、分光光度計(jì)類型

單波長(zhǎng)

分光光度計(jì)雙波長(zhǎng)

分光光度計(jì)單光束

分光光度計(jì)雙光束

分光光度計(jì)可見光區(qū):可紫外-見光區(qū):721型751，754型760型儀器簡(jiǎn)單，單色光誤差大儀器簡(jiǎn)單，要求光強(qiáng)度穩(wěn)定高普遍采用的光路wfz800-S,日本島津UV-300型特定情況（背景、共存組分干擾）下使用各種分光光度計(jì)使用《化學(xué)教學(xué)網(wǎng)》視頻操作第18頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三第四節(jié)分析條件的選擇一、測(cè)量條件的選擇1.吸光度的范圍：T∈20%~65%，A∈0.2～0.7之間吸收最大的波長(zhǎng)為入射光，干擾最小二、顯色反應(yīng)條件的選擇

顯色反應(yīng)：將試樣組分轉(zhuǎn)變成有較強(qiáng)吸收的有色化合物的反應(yīng)。顯色劑：與被測(cè)組分化合生成有色物質(zhì)的試劑。1.顯色反應(yīng)的條件：(1)定量反應(yīng)、選擇性要好；干擾少。(2)靈敏度要高，摩爾吸光系數(shù)ε大。(3)有色化合物的組成要恒定，化學(xué)性質(zhì)要穩(wěn)定。(4)有色化合物與顯色劑的最大吸收波長(zhǎng)之差≥60nm。(5)顯色反應(yīng)的條件要易于控制。2.測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：M十R＝MR

（被測(cè)物）（顯色劑）（有色配合物）第19頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、參比溶液（空白溶液）的選擇

用于調(diào)節(jié)100%T，若選擇不適當(dāng)，對(duì)測(cè)量讀數(shù)的影響較大。主要是消除溶液中其他組分對(duì)光的吸收等帶來(lái)的影響。1.溶劑參比液當(dāng)試液、試劑、顯色劑均無(wú)色時(shí)，用溶劑(通常是蒸餾水)作參比液；3.試劑參比液如果顯色劑或其他試劑略有吸收，可用不含待測(cè)組分的試劑溶液作參比溶液。2.試樣參比液如果試樣中的其他組分也有吸收，但不與顯色劑反應(yīng)，則當(dāng)顯色劑無(wú)吸收時(shí)，可用試樣溶液作參比溶液。4.平等操作參比液用不含待測(cè)組分的溶液，在相同條件下與待測(cè)試樣同時(shí)進(jìn)行處理，此為平行操作參比溶液。第20頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三定性與定量分析紫外-可見分光光度法主要用于有機(jī)物分析。定性分析：比較吸收光譜特征可以對(duì)純物質(zhì)進(jìn)行鑒定及雜質(zhì)檢查；定量分析：利用光吸收定律進(jìn)行分析（一）定性鑒別：一、定性分析對(duì)比法：比較樣品化合物的吸收光譜特征與標(biāo)準(zhǔn)化合物的吸收光譜特征；或與文獻(xiàn)所載的化合物的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行核對(duì)。同一物質(zhì)有相同吸收光譜圖，反之不一定是同一物質(zhì)。第21頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三咖啡因樣品用紫外光譜定性和定量，上：標(biāo)準(zhǔn)品；下：樣品第22頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、對(duì)比吸光度（或吸光系數(shù)）相同條件下，同一物質(zhì)吸光度比值是吸光系數(shù)的比值。（二）純度檢查1、雜質(zhì)檢查：有雜質(zhì)時(shí)，吸收光譜變形。2、雜質(zhì)限量檢查：①以某一波長(zhǎng)吸光度值表示；②以峰谷吸光度比值表示。3、對(duì)比吸收光譜的一致性將試樣與已知標(biāo)準(zhǔn)樣品用同一溶劑配制成相同濃度的溶液，在同一條件下分別掃描吸收光譜，核對(duì)其一致性。1、對(duì)比吸收光譜特征數(shù)據(jù)：λmax、λmin、λsh①不同基團(tuán)化合物可能有相同的λmax值，但εmax有明顯差別；②有相同吸光基團(tuán)同系物，其λmax、εmax值接近，但分子量不同，E1%1cm差別大。A1/A2=E1/E2第23頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三例1：阿司匹林在空氣中容易吸收水分產(chǎn)生水楊酸，阿司匹林在280nm處有強(qiáng)吸收峰，而水楊酸的吸收峰遷移到312nm，只要檢測(cè)在312nm處是否有吸收峰，即可判斷有無(wú)水楊酸。例2：無(wú)水乙醇精制過(guò)程中要用苯，測(cè)定無(wú)水乙醇中是否殘留苯，測(cè)定其吸收光譜，乙醇在210~600nm之間無(wú)吸收峰，而苯在250、254nm有吸收峰，以純無(wú)水乙醇為參比，對(duì)樣品進(jìn)行光譜分析，如果在250、254nm處出現(xiàn)吸收峰，則說(shuō)明有苯殘留。例3：如藥典規(guī)定VB12的E1%max，361nm，1cm=207，上述VB12注射液原標(biāo)示濃度為0.05%，求實(shí)際濃度，方法：藥液用重蒸水精確稀釋20倍，水做參比，用361nm測(cè)定的吸光度為0.512，其含量為：1%∶207=x%∶0.512，x%=0.00247%，濃度=0.00247%×20=0.049%

第24頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三溶劑對(duì)紫外光譜的影響在測(cè)定有機(jī)物的紫外可見吸收光譜時(shí)，在溶解度容許范圍內(nèi)，應(yīng)盡量選擇非極性溶劑或極性較小的溶劑（烷、烯烴，如正己烷、正庚烷），以獲得吸收光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)。

與標(biāo)準(zhǔn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比時(shí)，必須用相同的溶劑。所選擇的溶劑在所研究的光譜區(qū)域內(nèi)應(yīng)該沒(méi)有明顯的吸收；并且不含有其它干擾物質(zhì)；與溶質(zhì)沒(méi)有相互作用。否則會(huì)使光譜線產(chǎn)生移動(dòng)，低于此波長(zhǎng)時(shí)，溶劑的吸收不可忽略。第25頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三常用溶劑的波長(zhǎng)范圍如下：.

溶劑使用波長(zhǎng)范圍溶劑使用波長(zhǎng)范圍甲醇>210二氯甲烷>235.

乙醇>215氯仿>245.

水>210乙酸乙酯>260.

96%硫酸>210苯>280.

乙醚>215甲苯>285.第26頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、定量分析分光光度法被廣泛的應(yīng)用在各個(gè)領(lǐng)域，環(huán)境、醫(yī)藥、石油等測(cè)定無(wú)機(jī)、有機(jī)微量成份。由于操作簡(jiǎn)單，儀器廉價(jià)，一般說(shuō)是常用的首選方法。（一）單組分的定量分析1、標(biāo)準(zhǔn)曲線（工作曲線）法：配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在同一條件下分別測(cè)定吸光度，然后以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)繪制A-C關(guān)系曲線。●符合朗-伯定律，則得到一條通過(guò)原點(diǎn)的直線。●根據(jù)測(cè)得樣品吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得樣品溶液濃度，最后計(jì)算含量。原理:根據(jù)朗伯-比爾定律，選擇合適λ測(cè)A，求出濃度。第27頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法

以該物質(zhì)吸收光譜圖中max為入射光，配制一個(gè)與被測(cè)溶液濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液cS，測(cè)其AS，再將樣品溶液推入光路，測(cè)其AX，則試樣溶液的濃度cX為：例：VB12含量測(cè)定：精確吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀釋n倍，使其濃度約為30μg/ml，另外配VB12標(biāo)準(zhǔn)液濃度為30μg/ml，蒸餾水調(diào)零，用361nm測(cè)定吸光度A，計(jì)算：測(cè)定液中VB12含量（μg/ml）=（A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)品）×30；注射液中VB12含量（μg/ml）=（A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)品）×30×n（稀釋倍數(shù)）÷V（取樣量,ml）第28頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三（二）多組分的定量分析法

在含有多種組分的溶液中，如果要測(cè)定多個(gè)組分，可以根據(jù)情況的不同，采用不同的方法來(lái)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)量依據(jù)——吸光度的加和性：(1)(2)(3)第29頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三(1)圖計(jì)算法----兩組分吸收光譜不重疊（互不干擾）

a圖中，a,b組份最大吸收波長(zhǎng)λmax不重迭，相互不干擾，可以按兩個(gè)單一組份處理。(2)圖計(jì)算法---兩組分吸收光譜部分重疊①a、b兩組分的吸收光譜部分重疊，此時(shí)λ1處按單組分測(cè)定a組分濃度，b組分此處無(wú)干擾。②在λ2處測(cè)得混合溶液的總吸光度A2a+b,根據(jù)加和性計(jì)算cb，假設(shè)液層厚度為1cm,則：A2a+b=A2a+A2b=E2a·ca+E2b·cb第30頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三例：四環(huán)素和金霉素混合物的測(cè)定：四環(huán)素在0.25MNaOH中最大吸收峰為380nm，E1%1cm，λmax=372.0；在0.1MHCl中最大吸收峰為355nm，E1%1cm，λmax=303.2；兩吸收峰都可以做為四環(huán)素的測(cè)定波長(zhǎng)。但與金霉素共存時(shí)，因?yàn)榻鹈顾卦?55nm處有吸收（金霉素在0.1NHCl中E1%1cm，λmax=182.6），只能用380nm測(cè)定四環(huán)素?；旌蠘悠吩?55nm處測(cè)定二者的總吸光度,在380nm處測(cè)得四環(huán)素的吸光度，則兩者的濃度都可以求出。測(cè)定方法：(1)測(cè)定1%混合物在0.1MHCl溶液的吸光度A335(2)測(cè)定1%混合物在0.25MNaOH溶液的吸光度A380

計(jì)算：四環(huán)素濃度C1（g%）=[AC1，380/E1%（C1）1cm，380]=AC1，380/372.0金霉素濃度C2（g%）=[AC1+C2335－（E1%（C1）1cm，355×C1）]÷E1%（C2）1cm，355=[AC1+C2335－（303.2×AC1，380÷372.0）]÷182.6第31頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三(3)圖計(jì)算法----兩組分吸收光譜完全重疊--混合樣品測(cè)定

(3)圖中，a,b吸收光譜雙向重迭，互相干擾，在最大波長(zhǎng)處互相吸收。處理方法如下：1.解線性方程組法過(guò)程：第32頁(yè)，講稿共39頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.等吸收雙波長(zhǎng)法-注：須滿足兩個(gè)基本條件選定的兩個(gè)波長(zhǎng)下干擾組分具有等吸收點(diǎn)選定的兩個(gè)波長(zhǎng)下待測(cè)物的吸光度差值應(yīng)足夠大第