乙肝病毒檢測課件

病毒鑒定方法一、分離培養(yǎng)方法二、快速診斷方法1、光學(xué)顯微鏡檢查

病毒包涵體及某些大病毒顆粒的檢查2、電子顯微鏡的檢查

電鏡直接檢查免疫電鏡檢查3、血清學(xué)檢查4、病毒基因組檢查核酸雜交和聚合酶鏈反應(yīng)乙肝病毒檢測一、乙肝五項（兩對半）二、乙肝病毒核酸定量檢測

HBV抗原抗體系統(tǒng)檢測臨床意義HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義IgMIgG+-----感染或無癥狀攜帶者+-+-+-急性或慢性乙型肝炎（傳染性強(qiáng)）（大三陽）+--+-+急性肝炎趨向恢復(fù)（小三陽）-+-+-+既往感染恢復(fù)期-+-+--既往感染恢復(fù)期-----+既往感染-+----既往感染或接種疫苗------未感染，無免疫力二、乙肝病毒核酸定量檢測

1.檢測原理

利用熒光PCR技術(shù)，以HBV基因組中相對保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計特異引物及熒光探針，通過PCR對DNA進(jìn)行快速定量檢測。

熒光探針TaqMan探針實時熒光PCR技術(shù)。在PCR反應(yīng)過程中，同時利用Taq酶的5’→3’聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得TaqMan探針降解，熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離使得熒光信號發(fā)射，F(xiàn)AM熒光檢測乙型肝炎病毒JOE/RED610nm波長通道檢測內(nèi)參。

PCR分四個階段O<1為HbeAg陽性（含HbeAg陽性血清）在PCR反應(yīng)過程中，同時利用Taq酶的5’→3’聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得TaqMan探針降解，熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離使得熒光信號發(fā)射，F(xiàn)AM熒光檢測乙型肝炎病毒JOE/RED610nm波長通道檢測內(nèi)參。93℃45秒→55℃60秒→10個循環(huán)洗滌時各孔均加滿，防止孔內(nèi)有游離酶未洗凈影響結(jié)果在微孔板上預(yù)包被鼠抗-Hbe單克隆抗體（HbeAb），配以辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗-Hbe單克隆抗體（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基聯(lián)苯胺）等試劑，采用雙抗夾心法檢測血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）C<100,HBVDNA濃度<100IU/ml洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應(yīng)保持30-60秒的浸泡時間）未結(jié)合SYBRGreen1dye（含HbeAg陽性血清）HBV定量參考品（2.2FAM檢測通道擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)期且Ct值小于300E+008,HBVDNA濃度=CIU/ml一、乙肝五項（兩對半）Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。一、乙肝五項（兩對半）HBV抗原抗體系統(tǒng)檢測臨床意義4實驗無效，應(yīng)重新實驗（辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗-Hbe單克隆抗體）在微孔板上預(yù)包被鼠抗-Hbe單克隆抗體（HbeAb），配以辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗-Hbe單克隆抗體（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基聯(lián)苯胺）等試劑，采用雙抗夾心法檢測血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）如何定量？Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。定量原理

確定初始模板的濃度初始DNA量越多,熒光達(dá)到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數(shù)越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模板量熒光化學(xué)SYBRGreen1

TaqManTaqManSYBRGreenI工作原理

。SYBRGreen1

結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT未結(jié)合SYBRGreen1dye變性:無熒光信號2.所用試劑組分名稱規(guī)格數(shù)量主要成分

核酸提取試劑DNA提取液I4.5ml/瓶2DNA提取液質(zhì)控品及陽性定量參考品陰性質(zhì)控品250ul/管1HBV陰性血清強(qiáng)陽性質(zhì)控品250ul/管1滅活HBV陽性血清臨界陽性質(zhì)控品250ul/管1滅活HBV陽性血清HBV定量參考品（2.0X106IU/ml）250ul/管1滅活HBV陽性血清HBV定量參考品（2.0X105IU/ml）250ul/管1滅活HBV陽性血清HBV定量參考品（2.0X104IU/ml）250ul/管1滅活HBV陽性血清HBV定量參考品（2.0X103IU/ml）250ul/管1滅活HBV陽性血清

PCR檢測試劑HBV-內(nèi)標(biāo)溶液100ul/管1內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒及穩(wěn)定劑HBV-PCR反應(yīng)管1人一份/管20引物、探針、taq酶等3、實驗步驟1.DNA提取

將待測樣本、陽性定量參考品、陰性質(zhì)控品、HBV強(qiáng)陽性質(zhì)控品、HBV臨界質(zhì)控品進(jìn)行同步處理。1.1取200μL樣品，加入450μLDNA提取液I和4μL內(nèi)標(biāo)溶液，用振蕩器劇烈震蕩搖勻15秒，瞬時離心數(shù)秒，100℃處理10分鐘1.212000rpm離心5分鐘，備用2.PCR試劑準(zhǔn)備直接使用HBV-PCR反應(yīng)管3.加樣HBV-PCR反應(yīng)管分別加入將待測樣本、陽性定量參考品、陰性質(zhì)控品、HBV強(qiáng)陽性質(zhì)控品、HBV臨界質(zhì)控品上清20μL。蓋緊管蓋，8000rpm離心數(shù)秒后擴(kuò)增4.PCR擴(kuò)增對各標(biāo)本進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)條件：93℃2分鐘93℃45秒→55℃60秒→10個循環(huán)93℃30秒→45℃60秒→30個循環(huán)FAM通道檢測HBV核酸，VIC通道檢測內(nèi)標(biāo)4.結(jié)果判定1如果在FAM檢測通道檢測擴(kuò)增曲線無明顯對數(shù)期或Ct值等于30，VIC檢測通道擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)期，則為陰性或小于檢測靈敏度2FAM檢測通道擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)期且Ct值小于30按以下方法判斷：C<100,HBVDNA濃度<100IU/ml100≤C≤5.0E+008,HBVDNA濃度=CIU/mlC>5.0E+008,HBVDNA濃度>5.0X108IU/ml如需精確定量結(jié)果，可將樣品用陰性質(zhì)控品稀釋到線性范圍后再檢測，則樣品HBVDNA濃度=（CX稀釋倍數(shù)）IU/ml5.注意事項1每次實驗需檢測陰性質(zhì)控品、HBV強(qiáng)陽性質(zhì)控品、HBV臨界質(zhì)控品，滿足要求方可進(jìn)行判定（陽性質(zhì)控品Ct<30，陰性質(zhì)控品無明顯對數(shù)期或Ct值等于30VIC檢測通道擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)期）2本試劑盒的最低檢出濃度為30IU/ml，最低定量濃度為100IU/ml3所有樣品包括質(zhì)控品均按傳染性標(biāo)本對待嚴(yán)格遵循無菌操作（帶口罩手套），所有操作在生物安全柜內(nèi)操作，物品不能隨意帶出生物安全柜，用完的物品集中放置高壓滅菌后方可處置。一、乙肝病毒e抗原檢測

1.檢測原理

在微孔板上預(yù)包被鼠抗-Hbe單克隆抗體（HbeAb），配以辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗-Hbe單克隆抗體（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基聯(lián)苯胺）等試劑，采用雙抗夾心法檢測血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）

臨界值=陰性對照孔OD值均值NX2.（包被鼠抗-Hbe單克隆抗體（HbeAb））二、乙肝病毒核酸定量檢測急性或慢性乙型肝炎（傳染性強(qiáng)）（大三陽）核酸提取試劑二、乙肝病毒核酸定量檢測注意：陰性對照孔均值N大于0.免疫電鏡檢查利用熒光PCR技術(shù)，以HBV基因組中相對保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計特異引物及熒光探針，通過PCR對DNA進(jìn)行快速定量檢測。0X104IU/ml）0E+008,HBVDNA濃度>5.93℃30秒→45℃60秒→30個循環(huán)Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。一、乙肝五項（兩對半）4實驗無效，應(yīng)重新實驗2FAM檢測通道擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)期且Ct值小于3093℃30秒→45℃60秒→30個循環(huán)洗滌時各孔均加滿，防止孔內(nèi)有游離酶未洗凈影響結(jié)果分別用加樣器加入陽性對照血清、陰性對照血清50μL（各加兩孔），待測血清50μL（1孔），空白對照（不加）一、乙肝五項（兩對半）在微孔板上預(yù)包被鼠抗-Hbe單克隆抗體（HbeAb），配以辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗-Hbe單克隆抗體（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基聯(lián)苯胺）等試劑，采用雙抗夾心法檢測血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）2.所用試劑組成成分規(guī)格組成成分規(guī)格1.HbeAg微孔板（包被鼠抗-Hbe單克隆抗體（

HbeAb））96TX塊7.底物B（過氧化氫）7mlX1支2.HbeAg酶標(biāo)抗體（辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗-Hbe單克隆抗體）3.5mlX1支8.終止液7mlX1支3.HbeAg陽性對照血清（含HbeAg陽性血清）1mlX1支9.封口膜2張4.HbeAg陰性對照血清（正常人血清）1mlX1支10.自封袋1個5.濃縮洗滌（PBS-T緩沖液）12.5mlX1支11.說明書1張6.底物A（過氧化氫）7mlX1支

3、實驗步驟1.平衡

試劑盒個組分取出，平衡至室溫（16-25℃）余者以自封袋封存2.配液濃縮洗滌液搖勻后，用蒸餾水或去離子水按1:19稀釋備用3.編號微孔條固定于支架，按序編號4.加樣

分別用加樣器加入陽性對照血清、陰性對照血清50μL（各加兩孔），待測血清50μL（1孔），空白對照（不加）5.加酶

每空加酶標(biāo)抗體50μL，混勻（空白對照不加）6.溫浴37℃溫浴25分鐘，室溫平衡5分鐘（封口膜覆蓋孔口，避免其他因素影響）7.洗滌

洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應(yīng)保持30-60秒的浸泡時間）8.顯色

每孔加入A、B底物50μL，混勻，37℃暗置15分鐘9.終止每孔加50μL終止液50μL，混勻10.測定

酶標(biāo)儀單波長450nm或雙波長450/630nm測定各空OD值，記錄結(jié)果,30分鐘內(nèi)測定完成）4.結(jié)果判定1.臨界值(C.O)計算臨界值=陰性對照孔OD值均值NX2.1

注意：陰性對照孔均值N大于0.1應(yīng)重新實驗，小于0.05按0.05計算2.結(jié)果判定樣品OD值/C.O≥1為HbeAg陽性樣品OD值/C.O<1為HbeAg陽性3.陰性對照孔均值N大于0.1或陽性對照均值≤0.4實驗無效，應(yīng)重新實驗5.注意事項1.洗滌時各孔均加滿，防止孔內(nèi)有游離酶未洗凈影響結(jié)果2.所有樣品包括質(zhì)控品均按傳染性標(biāo)本對待嚴(yán)格遵循無菌操作（帶口罩手套），所有操作在生物安全柜內(nèi)操作，物品不能隨意帶出生物安全柜，用完的物品集中放置高壓滅菌后方可處置。3.微孔板拆封后，取出當(dāng)天用的微孔條后，其余用封口膜封存避免受潮PCR分四個階段如何定量？Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。4.結(jié)果判定1如果在FAM檢測通道檢測擴(kuò)增曲線無明顯對數(shù)期或Ct值等于30，VIC檢測通道擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)期，則為陰性或小于檢測靈敏度2FAM檢測通道擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)期且Ct值小于30按以下方法判斷：C<100,HBVDNA濃度<100IU/ml100≤C≤5.0E+008,HBVDNA濃度=CIU/mlC>5.0E+008,HBVDNA濃度>5.0X108IU/ml如需精確定量結(jié)果，可將樣品用陰性質(zhì)控品稀釋到線性范圍后再檢測，則樣品HBVDNA濃度=（CX稀釋倍數(shù)）IU/ml0E+008,HBVDNA濃度=CIU/ml0X104IU/ml）1或陽性對照均值≤0.酶標(biāo)儀單波長450nm或雙波長450/630nm測定各空OD值，記錄結(jié)果,30分鐘內(nèi)測定完成）0E+008,HBVDNA濃度>5.1如果在FAM檢測通道檢測擴(kuò)增曲線無明顯對數(shù)期或Ct值等于30，VIC檢測通道擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)期，則為陰性或小于檢測靈敏度HBV定量參考品（2.HbeAg陰性對照血清HbeAg陰性對照血清FAM通道檢測HBV核酸，VIC通道檢測內(nèi)標(biāo)0X108IU/ml如需精確定量結(jié)果，可將樣品用陰性質(zhì)控品稀釋到線性范圍后再檢測，則樣品HBVDNA濃度=（CX稀釋倍數(shù)）IU/ml每空加酶標(biāo)抗體50μL，混勻（空白對照不加）（辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗-Hbe單克隆抗體）一、乙肝五項（兩對半）0E+008,HBVDNA濃度>5.在微孔板上預(yù)包被鼠抗-Hbe單克隆抗體（HbeAb），配以辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗-Hbe單克隆抗體（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基聯(lián)苯胺）等試劑，采用雙抗夾心法檢測血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）每孔加50μL終止液50μL，混勻Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。1取200μL樣品，加入450μLDNA提取液I和4μL內(nèi)標(biāo)溶液，用振蕩器劇烈震蕩搖勻15秒，瞬時離心數(shù)秒，100℃處理10分鐘C<100,HBVDNA濃度<100IU/ml洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應(yīng)保持30-60秒的浸泡時間）洗滌時各孔均加滿，防止孔內(nèi)有游離酶未洗凈影響結(jié)果HBV-PCR反應(yīng)管分別加入將待測樣本、陽性定量參考品、陰性質(zhì)控品、HBV強(qiáng)陽性質(zhì)控品、HBV臨界質(zhì)控品上清20μL。將待測樣本、陽性定量參考品、陰性質(zhì)控品、HBV強(qiáng)陽性質(zhì)控品、HBV臨界質(zhì)控品進(jìn)行同步處理。0X108IU/ml如需精確定量結(jié)果，可將樣品用陰性質(zhì)控品稀釋到線性范圍后再檢測，則樣品HBVDNA濃度=（CX稀釋倍數(shù)）IU/ml在微孔板上預(yù)包被鼠抗-Hbe單克隆抗體（HbeAb），配以辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗-Hbe單克隆抗體（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基聯(lián)苯胺）等試劑，采用雙抗夾心法檢測血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）（含HbeAg陽性血清）SYBRGreen1每孔加入A、B底物50μL，混勻，37℃暗置15分鐘（辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗-Hbe單克隆抗體）3所有樣品包括質(zhì)控品均按傳染性標(biāo)本對待嚴(yán)格遵循無菌操作（帶口罩手套），所有操作在生物安全柜內(nèi)操作，物品不能隨意帶出生物安全柜，用完的物品集中放置高壓滅菌后方可處置。每孔加入A、B底物50μL，混勻，37℃暗置15分鐘質(zhì)控品及陽性定量參考品Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。所有樣品包括質(zhì)控品均按傳染性標(biāo)本對待嚴(yán)格遵循無菌操作（帶口罩手套），所有操作在生物安全柜內(nèi)操作，物品不能隨意帶出生物安全柜，用完的物品集中放置高壓滅菌后方可處置。93℃30秒→45℃60秒→30個循環(huán)2FAM檢測通道擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)期且Ct值小于30二、乙肝病毒核酸定量檢測HbeAg陰性對照血清利用熒光PCR技術(shù)，以HBV基因組中相對保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計特異引物及熒光探針，通過PCR對DNA進(jìn)行快速定量檢測。0E+008,HBVDNA濃度=CIU/ml（含HbeAg陽性血清）2.所用試劑組成成分規(guī)格組成成分規(guī)格1.HbeAg微孔板（包被鼠抗-Hbe單克隆抗體（

HbeAb））96TX塊7.底物B（過氧化氫）7mlX1支2.HbeAg酶標(biāo)抗體（辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗-Hbe單克隆抗體）3.5mlX1支8.終止液7mlX1支3.HbeAg陽性對照血清（含HbeAg陽性血清）1mlX1支9.封口膜2張4.HbeAg陰性對照血清（正常人血清）1mlX1支10.自封袋1個5.濃縮洗滌（PBS-T緩沖液）12.5mlX1支11.說明書1張6.底物A（過氧化氫）7mlX1支

利用熒光PCR技術(shù)，以HBV基因組中相對保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計特異引物及熒光探針，通過PCR對DNA進(jìn)行快速定量檢測。2FAM檢測通道擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)期且Ct值小于301如果在FAM檢測通道檢測擴(kuò)增曲線無明顯對數(shù)期或Ct值等于30，VIC檢測通道擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)期，則為陰性或小于檢測靈敏度93℃30秒→45℃60秒→30個循環(huán)核酸雜交和聚合酶鏈反應(yīng)HBV定量參考品（2.洗滌時各孔均加滿，防止孔內(nèi)有游離酶未洗凈影響結(jié)果0X106IU/ml）蓋緊管蓋，8000rpm離心數(shù)秒后擴(kuò)增濃縮洗滌液搖勻后，用蒸餾水或去離子水按1:19稀釋備用1取200μL樣品，加入450μLDNA提取液I和4μL內(nèi)標(biāo)溶液，用振蕩器劇烈震蕩搖勻15秒，瞬時離心數(shù)秒，100℃處理10分鐘Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。質(zhì)控品及陽性定量參考品93℃45秒→55℃60秒→10個循環(huán)二、乙肝病毒核酸定量檢測引物、探針、taq酶等二、乙肝病毒核酸定量檢測2FAM檢測通道擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)期且Ct值小于30洗滌時各孔均加