細胞融合-與-單克隆抗體

細胞融合與單克隆抗體(kàngtǐ)CellFusionandMonoclonalAntibodies第一頁，共六十二頁。精選ppt4.1細胞融合4.2雜種細胞的遺傳特性(tèxìng)和應(yīng)用4.3淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體技術(shù)第二頁，共六十二頁。精選ppt4.1細胞融合4.11聚乙二醇介導(dǎo)的細胞融合4.12細胞電融合4.13雜種(zázhǒng)細胞的篩選第三頁，共六十二頁。精選ppt4.1細胞融合定義：指用自然或人工方法、使兩個或更多個不同的細胞融合成一個細胞的過程，又稱為(chēnɡwéi)體細胞雜交第四頁，共六十二頁。精選ppt4.11聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的細胞融合

原理：PEG帶有大量的負電荷,和原生質(zhì)體表面的負電荷在鈣離子的連接下，形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著和結(jié)合，在高pH,高鈣離子的溶液的作用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)(shītiáo)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的正負電荷連接起來，進而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。第五頁，共六十二頁。精選ppt影響(yǐngxiǎng)因素：

分子量：400—6000（通常：1000—4000）濃度：20—60%（通常：30—50%）時間：懸浮法1—2min

離心法5—8minpH：偏堿為宜（pH7.4—8.0）其他：二甲(èrjiǎ)亞砜、植物血凝素第六頁，共六十二頁。精選ppt4.12細胞(xìbāo)電融合原理：懸于大小不同的兩平行電極間的低導(dǎo)電率溶液中的細胞，在1—100MHz和100—1000V/cm的交流電場中，會向小電極移動，并極化成偶極子，而沿電場方向發(fā)生(fāshēng)雙向電泳，此時再加上適當(dāng)強度和持續(xù)時間的高壓電脈沖，即可使相鄰細胞膜的接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電降解，從而觸發(fā)細胞融合。第七頁，共六十二頁。精選ppt雙向電泳：在交流電場的作用下（1MHz，150V/cm）細胞(xìbāo)膜上正負電荷分離，產(chǎn)生偶極，兩個極化的細胞(xìbāo)會發(fā)生相互的緊密接觸。第八頁，共六十二頁。精選ppt可逆電降解(jiànɡjiě)：在高頻電場的脈沖作用下（50ms，電場強度1.2－2kV/cm），細胞膜上的離子發(fā)生位移，而使電荷分開，細胞質(zhì)膜產(chǎn)生電勢，正、負電荷相互吸引，細胞膜變薄，隨細胞勢的增加，膜降解穿孔，形成微孔。電場誘發(fā)的微孔面積和數(shù)目與細胞膜總表面積相對不大時，微孔可以重新封閉。第九頁，共六十二頁。精選ppt電場(diànchǎng)示意圖第十頁，共六十二頁。精選ppt甜菜(tiáncài)原生質(zhì)體電融合過程1）在高頻電流電場下的相互接觸(jiēchù)。2）脈沖刺激后30s3)50秒后4）1.5分鐘后5）6分鐘后6）15分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。第十一頁，共六十二頁。精選ppt注意事項1）對介質(zhì)要求高，一般用高純度的蒸餾水并選用(xuǎnyòng)適當(dāng)?shù)姆请娊橘|(zhì)溶液，如甘露醇等配制等滲性介質(zhì)。2）注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓的強度和時間，以防止細胞連接成串或發(fā)生可逆性降解。第十二頁，共六十二頁。精選ppt優(yōu)點(yōudiǎn)：融合(rónghé)率高，達70％－80％，甚至100％融合率＝（融合組多核細胞的核數(shù)－對照組多核細胞的核數(shù)/對照組的全部細胞數(shù)）×100％可在顯微鏡下定向誘導(dǎo)細胞融合可直接挑選雜種細胞第十三頁，共六十二頁。精選ppt4.13雜種細胞(xìbāo)的篩選原理：兩種親本細胞融合的混合物中可能(kěnéng)有多種類型細胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細胞。1）親本2）同核體：同源原生質(zhì)體的融合體3）異核體：非同源的原生質(zhì)體的融合體4）多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體5）異胞質(zhì)體：具有不同胞質(zhì)來源的雜合細胞。6）核質(zhì)體：有細胞核而帶有少量細胞質(zhì)的亞原生質(zhì)體第十四頁，共六十二頁。精選ppt植物(zhíwù)細胞篩選方式1）遺傳互補篩選法：利用每一親本貢獻一個功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細胞表現(xiàn)正常。如親本1：葉綠體缺陷型親本2：光致死型兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白色，融合細胞長成植株呈綠色(lǜsè)，并能成長第十五頁，共六十二頁。精選ppt2）抗性互補篩選法：利用親本細胞原生質(zhì)體對抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異(chāyì)選擇雜種細胞。如：親本1：對放線菌素D抗性，但在MS培養(yǎng)基上不能超過50個世代親本2：對放線菌素D很敏感，但能在MS上生長雜種細胞能在含有放線菌素的MS培養(yǎng)基上生長，而親本和其它細胞死亡第十六頁，共六十二頁。精選ppt3）利用物理特性篩選法：根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異篩選雜種細胞。親本1：用異硫氰酸熒光素染色原生質(zhì)體親本2：葉肉細胞原生質(zhì)體在熒光顯微鏡下，親本1為紅色(hóngsè)，親本2為綠色，雜種細胞可以區(qū)分第十七頁，共六十二頁。精選ppt4）利用生長特性篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細胞。例如粉蘭煙草與朗氏煙草細胞原生質(zhì)體均需外源激素才能生長，但其融合細胞可以(kěyǐ)產(chǎn)生內(nèi)源激素，在培養(yǎng)基上不需加激素。第十八頁，共六十二頁。精選ppt動物細胞的篩選(shāixuǎn)方式：1）利用抗藥性篩選系統(tǒng)：利用生物細胞對藥物敏感性差異篩選雜種細胞。親本A：對氨芐青霉素敏感，對卡娜霉素不敏感親本B：對卡娜霉素敏感，對氨芐青霉素不敏感雜種細胞可以在含有(hányǒu)兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長第十九頁，共六十二頁。精選ppt2）營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)：細胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成分時，不能生長(shēngzhǎng)繁殖，即營養(yǎng)缺陷型細胞。利用兩種親本細胞營養(yǎng)互補作用原理可以篩選雜種細胞。親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細胞均會死亡。第二十頁，共六十二頁。精選ppt3）溫度敏感(mǐngǎn)突變型雜種細胞的篩選：一般的培養(yǎng)細胞能在32度到40度的范圍內(nèi)生長，但溫度敏感突變型的細胞能在高溫或低溫下生長。由此篩選雜種細胞。親本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生長。親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡娜霉素。雜種細胞能在高溫和含卡娜霉素的培養(yǎng)基上生長。第二十一頁，共六十二頁。精選ppt4.2雜種細胞的遺傳特性和應(yīng)用(yìngyòng)4.21雜種細胞在細胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用4.23雜種細胞在植物育種中的應(yīng)用第二十二頁，共六十二頁。精選ppt4.21雜種(zázhǒng)細胞在細胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用1）基因定位不同種屬的細胞融合時，常會出現(xiàn)一個親本細胞的染色體被優(yōu)先排除，而另一個親本的染色體被選擇性留下，即染色體分離的現(xiàn)象。由此，可根據(jù)表型和與表型特征(tèzhēng)相對應(yīng)的基因在特定染色體上。例如：HGPRT－人細胞與TK－的小鼠細胞融合后，可用HAT培養(yǎng)基分離得到一種僅含一條人E組染色體的雜種細胞，具有TK活性，由此得到人的TK基因是在E組染色體上的。第二十三頁，共六十二頁。精選ppt2）體細胞雜種的致瘤性分析通過正常二倍體細胞和致瘤性或病毒轉(zhuǎn)化細胞的融合來進行致瘤性的遺傳分析。3）遺傳缺陷的基因互補基于雜種細胞的基因互補作用，可分為基因間和基因內(nèi)的互補作用，即雜種細胞可以具有兩種親本在遺傳上缺陷的基因表型。通過這種基因互補，可以用正?；騺碇委熡捎?yóuyú)基因突變或基因缺失的疾病。第二十四頁，共六十二頁。精選ppt4）分化功能表達(biǎodá)調(diào)控的研究通過細胞融合可將不同分化狀態(tài)或組織類型的細胞構(gòu)建成為能夠存活的種內(nèi)或種間雜種，同時對雜種細胞內(nèi)的基因組和胞質(zhì)觀察和分析，了解如何通過相互作用而最終導(dǎo)致原先表達的分化性狀熄滅或保留。第二十五頁，共六十二頁。精選ppt4.22雜種(zázhǒng)細胞在植物育種中的應(yīng)用雜種細胞是一條新的育種途徑，可以產(chǎn)生新經(jīng)濟性狀的良種?？茖W(xué)家已經(jīng)在禾本科、茄科、豆科、十字花科等植物中得到了雜種再生植株。一些近親(jìnqīn)植物、有性不親和的組合，如馬鈴薯×番茄等都得到了再生植株。目標(biāo)：地上和地下部兼用種、固氮禾等具有兩種不同優(yōu)勢性狀的新品種。第二十六頁，共六十二頁。精選ppt4.3單克隆抗體4.31抗體的結(jié)構(gòu)與功能4.32單克隆抗體的制備(zhìbèi)和生產(chǎn)4.34單克隆抗體的改造和應(yīng)用第二十七頁，共六十二頁。精選ppt4.31抗體的結(jié)構(gòu)(jiégòu)與功能第二十八頁，共六十二頁。精選ppt第二十九頁，共六十二頁。精選ppt抗體是由B細胞受抗原刺激后所分泌的蛋白質(zhì)。抗體分子：由四條肽鏈所組成，兩條重鏈（H鏈）兩條輕鏈（L鏈）。結(jié)合區(qū)：抗體分子上有兩個(liǎnɡɡè)抗原結(jié)合區(qū)可變區(qū)（V區(qū)）穩(wěn)定區(qū)（C區(qū)）第三十頁，共六十二頁。精選ppt人體內(nèi)的五種(wǔzhǒnɡ)抗體第三十一頁，共六十二頁。精選ppt4.32單克隆抗體(kàngtǐ)的制備單克隆抗體(monoclonalantibody，簡稱McAb)：將能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞和具有無限增殖力的骨髓瘤細胞融合在一起，形成雜交瘤細胞。雜交瘤細胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體。這種單一類型的只針對(zhēnduì)某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。第三十二頁，共六十二頁。精選ppt單抗的制備(zhìbèi)過程動物免疫與親本細胞的選擇細胞融合：淋巴細胞雜交瘤的制備雜交瘤細胞的篩選：有限稀釋(xīshì)法等單克隆抗體的制備和凍存單克隆抗體的純化第三十三頁，共六十二頁。精選ppt親本(qīnběn)細胞的選擇骨髓瘤細胞：一般不分泌抗體，能在體外無限繁殖和連續(xù)(liánxù)繼代培養(yǎng)，且為HPRT－或TK－。多用BALB/C小鼠的骨髓瘤細胞。第三十四頁，共六十二頁。精選ppt淋巴細胞：經(jīng)過(jīngguò)免疫處理的淋巴細胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：體內(nèi)法或體外法。體內(nèi)法：對細胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動物體內(nèi)。3－4天后，在無菌條件下可以取出脾或淋巴結(jié)制成懸液，存活率在95％以上的可以用于融合。體外法：直接提取大、小鼠淋巴細胞，調(diào)整為107個/ml，加適當(dāng)濃度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴細胞。

第三十五頁，共六十二頁。精選ppt細胞融合將免疫脾細胞(xìbāo)和小鼠骨髓細胞(xìbāo)以2：1或10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)，1200rpm離心7—10分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細胞鋪展成薄層，在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%的PEG0.5ml，隨后靜置90秒，再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入5－10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用，再靜置10分鐘。第三十六頁，共六十二頁。精選pptHAT培養(yǎng)基篩選(shāixuǎn)雜交瘤細胞細胞團塊分散后，加HAT溶液(róngyè)，稀釋至骨髓瘤細胞不超過2×105ml，即可加入有飼養(yǎng)細胞的96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；總量分別為0.2ml和1ml。用HAT選擇性培養(yǎng)時每隔2－3天半量換液，7天后可以選擇出雜交瘤細胞。第三十七頁，共六十二頁。精選ppt細胞融合的選擇(xuǎnzé)示意圖第三十八頁，共六十二頁。精選pptHAT選擇(xuǎnzé)系統(tǒng)HAT是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分(chéngfèn)與細胞DNA合成有關(guān)。DNA合成途徑有兩種。第三十九頁，共六十二頁。精選ppt雜交瘤技術(shù)中，常選用(xuǎnyòng)次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤細胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細胞為親本之一。HPRT-細胞的嘌呤只能由全合成途徑產(chǎn)生；TK-

細胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。含氨基喋呤培養(yǎng)基抑制了細胞內(nèi)嘌呤和嘧啶的全合成途徑。第四十頁，共六十二頁。精選ppt嘌呤(piàolìng)合成通路的阻斷第四十一頁，共六十二頁。精選ppt淋巴細胞具有合成DNA的兩條途徑。雜種細胞通過(tōngguò)互補作用獲得HRPT或TK基因，可應(yīng)用培養(yǎng)基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通過補救合成途徑合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中，HPRT-

或TK-

親本細胞死亡，淋巴細胞亦逐漸死亡，只有雜種細胞存活。第四十二頁，共六十二頁。精選ppt特異性雜交瘤細胞(xìbāo)的篩選通過選擇性培養(yǎng)后生長的雜交瘤細胞，僅有部分是分泌預(yù)定特異性抗體的雜交瘤細胞。可取上清液，根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體類型及所需靈敏度等具體情況來加以選擇。可溶性抗原可采用放射免疫、免疫酶標(biāo)測定、間接血凝等方法測定。細胞抗原可采用免疫熒光、51Cr釋放(shìfàng)試驗、溶血空斑測定、補體依賴的細胞毒等方法直接測定針對這些抗原的抗體。第四十三頁，共六十二頁。精選ppt利用培養(yǎng)基對單抗進行(jìnxíng)鑒定的過程第四十四頁，共六十二頁。精選ppt雜交瘤細胞(xìbāo)的克隆化培養(yǎng)利用單個細胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細胞系。在培養(yǎng)過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進雜交瘤生長的飼養(yǎng)細胞，如小鼠的腹腔巨噬細胞、脾細胞或胸腺細胞等。方法有有限稀釋法、軟瓊脂(qióngzhī)培養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光激活分選儀等。第四十五頁，共六十二頁。精選ppt有限(yǒuxiàn)稀釋法通過適當(dāng)?shù)南♂屵_到分離單個細胞進行培養(yǎng)的目的1）取出陽性孔內(nèi)的細胞進行計數(shù)2）用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個細胞。3）如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml，其機率將為每孔內(nèi)落入一個細胞。4）加入一定數(shù)量的飼養(yǎng)細胞，經(jīng)過8~12天后，可觀察(guānchá)到有集落生長的孔。5）根據(jù)檢測的陽性結(jié)果再次進行克隆化。第四十六頁，共六十二頁。精選ppt軟瓊脂(qióngzhī)培養(yǎng)法在加入飼養(yǎng)細胞的無菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5％的瓊脂，待凝固(nínggù)后再鋪上一層混有雜交瘤細胞的0.25％的軟瓊脂。待細胞長成集落后，用毛細管吸出移種于含飼養(yǎng)細胞的96孔板內(nèi)。第四十七頁，共六十二頁。精選ppt單抗的大規(guī)模生產(chǎn)(shēngchǎn)1）誘生腹水將穩(wěn)定分泌(fēnmì)單抗的細胞株，通過擴大培養(yǎng)，接種于Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)增殖，從而得到大量含單抗的腹水。方法是將降植烷或石蠟油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接種3~5×106

雜交瘤細胞。10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中約含1~10mg單抗。2）利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)等進行大規(guī)模培養(yǎng)。第四十八頁，共六十二頁。精選ppt4.33

單克隆抗體(kàngtǐ)的改造和應(yīng)用單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等單克隆抗體靶向制劑，治療癌癥等疾病(jíbìng)雜交人－鼠單克隆抗體第四十九頁，共六十二頁。精選ppt單抗作為體內(nèi)體外診斷(zhěnduàn)試劑現(xiàn)在已經(jīng)有各種不同類型的單抗試劑合在市場出售，例如乙型肝炎的表面抗原，鐵蛋白、促絨毛膜性激素、促甲狀腺激素、癌癥、艾滋病等診斷(zhěnduàn)試劑。用同位素標(biāo)記的單抗在特定的組織中成象的技術(shù)可以用于腫瘤、心血管畸形的體內(nèi)診斷。第五十頁，共六十二頁。精選ppt1、單克隆抗體(kàngtǐ)靶向制劑1）藥物與單抗直接偶聯(lián)通過化學(xué)反應(yīng)使藥物分子的氨基與抗體分子的羧基(suōjī)之間直接形成穩(wěn)定的酰胺鍵。利用氧化劑把藥物分子上的糖基氧化成羰基。利用羰基與抗體分子的氨基反應(yīng)形成西佛氏堿，最后還原。這樣的靶向制劑保留一定的藥物活性，并具有一定的選擇性。如：1，4－溴柔紅霉素與腫瘤細胞單抗形成的偶合物，對腫瘤有明顯的選擇性毒性。第五十一頁，共六十二頁。精選ppt2）藥物通過小分子與單抗連接通過一些小分子交聯(lián)劑，把藥物分子上的某些基團連接起來。小分子交聯(lián)劑：如同型雙功能試劑，包括戊二醛、順烏頭酸酐、馬來酸酐、戊二酐；異型雙功能試劑：N－琥珀酰胺基－3－丙酸和寡肽等。順烏頭酸酐制成的最常用，在中性條件下較穩(wěn)定，在酸性條件下容易(róngyì)發(fā)生水解。這種靶向試劑與腫瘤的表面抗原結(jié)合后，會進入溶酶體，在酸性環(huán)境下釋放藥物，而殺死腫瘤細胞。第五十二頁，共六十二頁。精選ppt3）藥物通過大分子與抗體相連(xiānɡlián)大分子聚合物：葡聚糖、多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。總之，利用單抗試劑合可以作為靶向藥物，針對腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病、各種病原體病等。第五十三頁，共六十二頁。精選ppt2、雜交(zájiāo)人－鼠單克隆抗體鼠源抗體一般無法有效地激發(fā)宿主的免疫防衛(wèi)系統(tǒng)(xìtǒng)，還可能引發(fā)人對鼠源抗體本身的免疫反應(yīng)。在抗體中，F(xiàn)c片段在抗體中的作用是激活機體免疫反應(yīng)。對鼠源抗體進行改造，利用人源的Fc區(qū)域的DNA片段替換鼠源單抗的Fc的DNA片段。嵌合抗體可以保留其目標(biāo)專一性，降低人的抗鼠反應(yīng)。第五十四頁，共六十二頁。精選ppt一種制備人腫瘤(zhǒngliú)單克隆抗體的方案第五十五頁，共六十二頁。精選ppt3、人源單克隆抗體(kàngtǐ)方法1：分離人B細胞，使之與熒光標(biāo)記的抗原(kàngyuán)相結(jié)合，通過熒光標(biāo)記選擇能產(chǎn)生特殊抗體的B細胞，并用Epstein－Barr病毒轉(zhuǎn)化，得到少量的單抗。方法2：將人源免疫干細胞導(dǎo)入缺失大部分免疫細胞的小鼠體內(nèi)，遇到抗原時，產(chǎn)生人源的抗體。方法3：將改造過的人的抗體基因?qū)胧笈咛ブ?，能在免疫后得到產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因鼠第五十六頁，共六十二頁。精選ppt4、抗體(kàngtǐ)融合蛋白將抗體的可變區(qū)與一非抗體蛋白融合起來，使融合蛋白繼承有抗體分子的結(jié)合特異性。可以保留不同程度的抗體結(jié)合特異性和激發(fā)其他免疫(miǎnyì)反應(yīng)的能力。第五十七頁，共六十二頁。精選ppt5、