細(xì)胞增殖活性及原位檢測(cè)

細(xì)胞增殖活性原位

檢測(cè)(jiǎncè)技術(shù)及應(yīng)用重慶(zhònɡqìnɡ)醫(yī)科大學(xué)病理教研室葉秀峰第一頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞周期（CellCycle)一、細(xì)胞周期概述概念(gàiniàn)：細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂的細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個(gè)過(guò)程。

主要事件：遺傳信息載體DNA復(fù)制，通過(guò)有絲分裂將兩份拷貝DNA平均分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中第二頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt分期(fēnqī)：分為4個(gè)時(shí)期.即G1SG2M期第三頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt(一)Gl期(Gapphase)是指從有絲分裂完成到DNA復(fù)制之前這一階段，包括．RNAs及蛋白的合成，所以又稱(chēng)復(fù)制前期或合成前期。這一時(shí)期細(xì)胞主要活動(dòng)是為DNA的復(fù)制和蛋白質(zhì)合成作準(zhǔn)備，主要特點(diǎn)為：(1)各種細(xì)胞的G1期持續(xù)時(shí)間變化很大。這可能與細(xì)胞在此期增加質(zhì)量有關(guān)。因此，連續(xù)增殖細(xì)胞的增殖率是受G1期細(xì)胞的平均(píngjūn)時(shí)間長(zhǎng)度控制的，各種細(xì)胞群體之間細(xì)胞周期的差異取決于G1期的長(zhǎng)短。

第四頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt(2)此期發(fā)生了與DNA合成有關(guān)(yǒuguān)的事件，主要是RNA和蛋白質(zhì)的合成。(3)RNA合成發(fā)生于G1早期，同時(shí)RNA聚合酶水平也迅速增高。(4)G1早期合成結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白等，G1后期合成與DNA復(fù)制有關(guān)的酶類(lèi)，如胸苷激酶、脫氧核苷酸激酶等，其中DNA聚合酶活性在G1末期至S初期增高最快。(5)蛋白質(zhì)磷酸化增加。組蛋白磷酸化增加使染色體解旋，以利于DNA復(fù)制；非組蛋白磷酸化增加可能與基因的活化有關(guān)。(6)染色體狀態(tài)由凝集轉(zhuǎn)變?yōu)榻饽?，為DNA合成創(chuàng)造條件。(7)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能增強(qiáng)。第五頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt(二)S期(synthesisphase)即DNA合成期或復(fù)制期，S期主要是DNA合成(自我復(fù)制)、遺傳物質(zhì)從二倍體(2n)到四倍體(4n)的整個(gè)過(guò)程。其中(qízhōng)主要的生物化學(xué)改變是遺傳物質(zhì)的復(fù)制，即．DNA的復(fù)制及組蛋白、非組蛋白等染色體蛋白的合成。由于每一條染色體復(fù)制成兩條染色單體，在S期末，DNA含量增加一倍。DNA的準(zhǔn)確復(fù)制保證了分裂后子細(xì)胞遺傳物質(zhì)的平均分配。DNA合成的同時(shí)，形成新的染色質(zhì)的另一重要成分組蛋白的合成也同時(shí)進(jìn)行。第六頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt(三)G2期(Gap2phase)指DNA復(fù)制完成到有絲分裂開(kāi)始這段時(shí)間，這段時(shí)間內(nèi)細(xì)胞有2套二倍體染色體，所以(suǒyǐ)又稱(chēng)復(fù)制后期或合成后期。DNA復(fù)制完成后，細(xì)胞進(jìn)入G2期。處于此期的細(xì)胞DNA合成已終止，但仍然進(jìn)行著RNA和一定的蛋白合成，為細(xì)胞有絲分裂作準(zhǔn)備。第七頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt(四)M期(mitosisphase)即有絲分裂期，細(xì)胞在M期進(jìn)行分裂。M期又分為前期、前中期、中期、后期、末期。M期的末期一結(jié)束，就形成兩個(gè)新的子細(xì)胞，一次細(xì)胞周期即告結(jié)束，細(xì)胞就進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期的G1期。細(xì)胞有絲分裂是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，必須在DNA復(fù)制完成(wánchéng)后，細(xì)胞才能進(jìn)行有絲分裂。此期細(xì)胞呈球形，不很牢固地附在它生長(zhǎng)的基質(zhì)上。染色體在此期凝聚后分開(kāi)，移向細(xì)胞兩端，解聚并再形成兩個(gè)完整的核，最后通過(guò)細(xì)胞質(zhì)分裂而結(jié)束M期。第八頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt第九頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt有絲分裂是一個(gè)核改組的連續(xù)過(guò)程(guòchéng)，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征可分為5個(gè)階段：前期(prophase)前中期(earlymetaphase)中期(metaphase)后期(anphase)末期(telophase)第十頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt1．前期這一期主要發(fā)生染色體凝集、分裂極的確定、核仁解體及核膜消失。2.前中期主要變化是紡錘體的形成和染色體排列在赤道面上形成赤道板。3．中期從染色體排列到赤道面上到兩條染色單體(子染色體)開(kāi)始趨向(qūxiàng)兩極，這段時(shí)期稱(chēng)為中期。中期的染色體濃縮成典型形態(tài)，在赤道面上形成赤道板。第十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt4．后期后期是姐妹染色單體分開(kāi)并移向兩極的時(shí)期，當(dāng)子染色體到達(dá)兩極時(shí)，此期結(jié)束。染色單體的分開(kāi)通常由著絲點(diǎn)開(kāi)始，即兩個(gè)著絲點(diǎn)先分開(kāi)，然后兩個(gè)染色單體的臂逐漸(zhújiàn)分開(kāi)，完全分開(kāi)后就向兩極移動(dòng)。

5．末期從子染色體到達(dá)兩極后開(kāi)始到形成兩個(gè)子細(xì)胞這段時(shí)期稱(chēng)為末期，包括子核的形成與胞質(zhì)分裂兩個(gè)過(guò)程。第十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt二、細(xì)胞周期的控制點(diǎn)細(xì)胞周期能夠順利地發(fā)生、發(fā)展和完成，取決于三個(gè)重要的控制點(diǎn)(controlpoint)，即決定G1期發(fā)生的G1控制點(diǎn)，決定S期發(fā)生的S控制點(diǎn)和決定M期發(fā)生的M控制點(diǎn)。每一個(gè)控制點(diǎn)控制著細(xì)胞周期一定階段的開(kāi)始，但只有在細(xì)胞周期前一個(gè)階段徹底完成以后才能發(fā)生。(一)G1控制點(diǎn):在G1期，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的趨向有3種可能性：一些細(xì)胞進(jìn)入S期，通過(guò)G2期及有絲分裂期，即進(jìn)入增殖周期；一些細(xì)胞離開(kāi)細(xì)胞周期，處于靜止期，又稱(chēng)G0期，它們?cè)谝欢ǖ臈l件刺激(tiáojiàncìjī)下可重新進(jìn)入增殖周期；第十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt還有一些細(xì)胞向分化方向發(fā)展，使細(xì)胞的功能向?qū)Ｒ换至涯芰呄驕p弱。

在正常情況下多細(xì)胞的哺乳動(dòng)物體內(nèi)(tǐnèi)的部分細(xì)胞處于非增殖狀態(tài)的休止期(Go期)，只在一定條件下才進(jìn)人G1期。在G1期的后期中存在一個(gè)類(lèi)似于酵母周期中起始點(diǎn)的限制點(diǎn)(restrictionpoint，簡(jiǎn)稱(chēng)R點(diǎn))，它在細(xì)胞的每一次分裂中具有控制作用，故稱(chēng)為G1控制點(diǎn)，只有通過(guò)R點(diǎn)的細(xì)胞才能進(jìn)入S-G2-M期。

第十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt在通過(guò)R點(diǎn)前必須合成(héchéng)一種不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)(p105RB)，當(dāng)它積累到一定量時(shí)才能通過(guò)R點(diǎn)而啟動(dòng)DNA合成(héchéng)。因?yàn)橐坏﹩?dòng)DNA合成(héchéng)后就可通過(guò)G2期而進(jìn)入M期，所以R點(diǎn)是控制細(xì)胞增殖的關(guān)鍵，由此出發(fā)，細(xì)胞可能有3種不同的命運(yùn)：

(1)繼續(xù)增殖細(xì)胞。這些細(xì)胞在分裂完成之后，可以超過(guò)R點(diǎn)繼續(xù)向前發(fā)展，它們不斷離開(kāi)G1期，并通過(guò)細(xì)胞增殖周期中的各個(gè)不同時(shí)期完成細(xì)胞分裂。如骨髓干細(xì)胞，胃、腸上皮中的基底細(xì)胞等。第十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt(2)暫時(shí)不增殖細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞在分裂完成后，暫時(shí)處于G。期，并在R點(diǎn)被阻留很長(zhǎng)時(shí)間。在正常情況下，這類(lèi)細(xì)胞不合成(héchéng)DNA也不分裂，但在一定條件下可再進(jìn)入細(xì)胞周期而進(jìn)行增殖。屬于這種類(lèi)型的有肝細(xì)胞、哺乳動(dòng)物的初級(jí)卵母細(xì)胞等。(3)不增殖細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞可以由R點(diǎn)走向分化細(xì)胞，并成為執(zhí)行專(zhuān)門(mén)功能的終末分化細(xì)胞。如神經(jīng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞、皮膚上皮的角質(zhì)細(xì)胞等。第十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt(二)S控制點(diǎn)細(xì)胞在G1期完成后，細(xì)胞質(zhì)中含有DNA復(fù)制的激活因子，叫S期激活因子(Sphaseactivator)。S期激活因子的量決定Gl期完成和細(xì)胞進(jìn)入S期的速度。DNA復(fù)制完成后，細(xì)胞結(jié)束S期進(jìn)入G2期，某些細(xì)胞可停在G2期，在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)入M期重新分裂。(三)M期控制點(diǎn)細(xì)胞開(kāi)始有絲分裂(yǒusīfēnliè)時(shí)需要M期激酶(Mphasekinase)激活。M期激酶是由2個(gè)亞單位第十七頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt組成，一個(gè)是催化亞單位p34；另一個(gè)是調(diào)節(jié)亞單位，它是一種細(xì)胞周期蛋白(cyclin)，可以是周期蛋白A或周期蛋白B，它們是在有絲分裂間期不斷合成并積累的。

p34本身沒(méi)有活性，當(dāng)它與調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)亞單位變構(gòu)形成p34-cyclinA或p34-cyclinB二聚體。二聚體中的p34蛋白絲氨酸與蘇氨酸殘基去磷酸化，產(chǎn)生激酶活性位點(diǎn)，使細(xì)胞進(jìn)入M期。在M期中，調(diào)節(jié)亞單位被破壞，使M期激酶失活，從而(cóngér)使分裂的兩個(gè)子細(xì)胞分開(kāi)，結(jié)束M期。第十八頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt

第二節(jié)細(xì)胞周期的調(diào)控目前，人們已揭示了細(xì)胞周期的主要生物化學(xué)過(guò)程，并獲得了自酵母至人類(lèi)普遍(pǔbiàn)適用的模式。一．細(xì)胞因子與相應(yīng)的受體細(xì)胞因子是一類(lèi)能與特異的、高親和性的細(xì)胞外基質(zhì)、可溶性受體及細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)，刺激細(xì)胞增殖的多肽類(lèi)物質(zhì)。生長(zhǎng)因子為一類(lèi)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子。根據(jù)生長(zhǎng)因子的靶細(xì)胞的不同，可將其第十九頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt

分為兩類(lèi)：一類(lèi)為具有廣泛作用(zuòyòng)的生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)等；另一類(lèi)為細(xì)胞特異性生長(zhǎng)因子，如白細(xì)胞介素2(IL-2)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)等。正常情況下，哺乳動(dòng)物體內(nèi)的大部分細(xì)胞處于非增殖狀態(tài)的G0期，此期細(xì)胞主要表達(dá)與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的基因，但不合成與細(xì)胞周期調(diào)控體系有關(guān)的蛋白。細(xì)胞因子作用于細(xì)胞表面的各種相應(yīng)的受體，受體多是增殖信號(hào)的跨膜傳遞者。這些受體都是糖蛋白，和生長(zhǎng)因子結(jié)第二十頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt

合后產(chǎn)生變構(gòu)，激活了蛋白激酶的活性，可使細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的酪氨酸發(fā)生磷酸化，進(jìn)一步觸發(fā)由細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的一系列信號(hào)傳遞反應(yīng)。核內(nèi)調(diào)控蛋白接受從細(xì)胞質(zhì)經(jīng)一系列反應(yīng)傳來(lái)的增殖信號(hào)后，才能變構(gòu)而被激活，與基因組中特定的調(diào)控序列發(fā)生相互作用，開(kāi)動(dòng)一組與細(xì)胞增殖調(diào)控有關(guān)的特定基因的轉(zhuǎn)錄，首先刺激fos、jun、myc等早期(zǎoqī)反應(yīng)基因的表達(dá)，并在這些轉(zhuǎn)錄因子的作用下，激活周期蛋白與周期蛋白依賴(lài)性激酶

第二十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt

的基因表達(dá)，合成與細(xì)胞周期調(diào)控體系有關(guān)的蛋白，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)行。下面介紹幾種主要的生長(zhǎng)因子及受體:(一)表皮生長(zhǎng)因子EGF是一種含有53個(gè)氨基酸殘基的多肽。EGF分子內(nèi)有對(duì)維持其生物活性必需的3個(gè)二硫鍵，當(dāng)用巰基乙醇或尿素還原二硫鍵后，EGF活性就會(huì)喪失。EGF主要分布于人的尿液、乳汁和血漿(xuèjiāng)中。作為一種作用很強(qiáng)的促細(xì)胞分裂因子，EGF能刺激多種組織細(xì)胞在體內(nèi)和體外的分裂和增殖。EGF是通過(guò)位于細(xì)胞膜上的受體而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的。EGF受體第二十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt(EGFR)是具有內(nèi)在的酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，EGFR的分布較廣泛，來(lái)源于內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的細(xì)胞均有EGFR表達(dá)。EGF與EGFR結(jié)合后形成復(fù)合物，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)EGF最終被溶酶體降解(jiànɡjiě)，EGFR在與EGF解離后被送回質(zhì)膜表面重新利用。(二)血小板衍化生長(zhǎng)因子血小板衍化生長(zhǎng)因子(platelet—derivedgrowthfactor，PDGF)來(lái)源于血小板，由含二硫鍵的二聚體組成，PDGF也是一種較強(qiáng)的促有絲分裂因子。第二十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選pptPDGF以啟動(dòng)性生長(zhǎng)因子的身份，刺激靜止細(xì)胞進(jìn)入對(duì)推進(jìn)因子敏感的狀態(tài)，離開(kāi)G0期進(jìn)入生長(zhǎng)周期。反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化基因v-sis的產(chǎn)物P28V-sis蛋白質(zhì)氨基酸的順序(shùnxù)與PDGF的β鏈同源，這說(shuō)明癌基因可能通過(guò)編碼生長(zhǎng)因子參與細(xì)胞增殖調(diào)控。PDGF也是通過(guò)與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合發(fā)揮作用的。PDGF受體(PDGFR)是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，通過(guò)與PDGF結(jié)合被活化，發(fā)揮多種生理活性。第二十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt(三)轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactor，F(xiàn)GF)是一組誘導(dǎo)非瘤細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)化表型的多肽類(lèi)物質(zhì)。FGF中最主要的有TGF-α和TGF-β兩大類(lèi)。TGF-α在結(jié)構(gòu)上與EGF相關(guān)，生物學(xué)特性非常相似。TGF-α和EGF都能與EGFR結(jié)合，結(jié)合后均可活化EGFR的蛋白激酶活性并誘導(dǎo)受體對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)鏈下游的調(diào)節(jié)作用。TGF-β不與EGFR結(jié)合，其受體是含二硫鍵的糖基化復(fù)合物。TGF-β的轉(zhuǎn)化活性需EGF或TGF-α的協(xié)同。TGF-β對(duì)于各種腫瘤細(xì)胞。第二十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt

如上皮細(xì)胞、胚胎成纖維細(xì)胞及大鼠的原代培養(yǎng)均為一種抑制增殖作用。因此，TGF-β可能主要是參與抑制細(xì)胞增殖。對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)節(jié)作用。(四)抑素抑素(chalone)是與生長(zhǎng)因子(yīnzǐ)作用相反的、具有組織特異性的內(nèi)源性、生理性生長(zhǎng)抑制因子(yīnzǐ)，其作用有組織或細(xì)胞特異性，而無(wú)種屬特異性。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，僅使細(xì)胞增殖阻滯于細(xì)胞周期某一時(shí)相，作用消失后，細(xì)胞增殖可被逆轉(zhuǎn)。第二十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt抑素是肽類(lèi)、蛋白質(zhì)或與糖結(jié)合的復(fù)合體，水溶性，存在于組織細(xì)胞和血清內(nèi)。目前確定的抑素有表皮細(xì)胞抑素、肝細(xì)胞抑素、紅細(xì)胞抑素、中性粒細(xì)胞抑素、淋巴細(xì)胞抑素等。各種抑素的分子量和理化性質(zhì)不同，其分子水平的作用尚不清楚。目前認(rèn)為抑素主要作用于G1～S期，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期的稱(chēng)為(chēnɡwéi)G1抑素或S因子，阻止細(xì)胞進(jìn)入M期的稱(chēng)為G2抑素或M因子。第二十七頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt二、周期蛋白與周期蛋白依賴(lài)性激酶對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控(一)周期蛋白與周期蛋白依賴(lài)性激酶過(guò)去人們一直認(rèn)為細(xì)胞周期受核的控制，細(xì)胞質(zhì)的活動(dòng)是被動(dòng)的。但研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中存在有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的因子，其活動(dòng)不完全受細(xì)胞核的控制，這種因子被稱(chēng)為有絲分裂促進(jìn)(cùjìn)因子(mitosispromotingfactor，MPF)。MPF由兩種蛋白分子組成，一種是“周期蛋白”(cyclin)，另一組分是具有蛋白激酶活性的催化亞單位，由于此激酶的活性依賴(lài)于和周期第二十八頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt蛋白結(jié)合，又稱(chēng)為周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶(cyclin—dependentkinase，CDK)。

已發(fā)現(xiàn)的周期蛋白有10多種，如酵母細(xì)胞中的Clnl、Cln2、Cln3及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的CyclinA、B、C、D、E、F、H等。依據(jù)它們?cè)诩?xì)胞周期中調(diào)控階段的不同(bùtónɡ)分別歸人G1期周期素和M期周期蛋白。在周期蛋白分子中都含有一段高度保守的氨基酸序列，它是與CDK互相結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)，稱(chēng)“周期蛋白盒”(cyclinbox)。周期蛋白周期性地合成、與CDK結(jié)合、降解，起到了對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用。第二十九頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選pptCDK是具有蛋白激酶活性的催化亞單位。目前已發(fā)現(xiàn)6種CDK。CDK與細(xì)胞分裂周期(celldivisioncycle，cdc)基因(jīyīn)cdc2編碼產(chǎn)物p34cdc具有同源性。與周期蛋白結(jié)合的p34cdc的活性還受其他某些特異性的激酶和磷酸酶的調(diào)控。包括Cdc2(CDKl)、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5和CDK6，它們分別對(duì)細(xì)胞G1-S期和G2-M期的過(guò)渡進(jìn)行調(diào)控。第三十頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G2期后，M期cyclin逐漸增加，并與CDK形成無(wú)活性MPF復(fù)合物，在其他激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)镸PF。通過(guò)MPF對(duì)這兩類(lèi)酶的正反饋調(diào)節(jié)作用，不斷加速M(fèi)PF的產(chǎn)生。當(dāng)MPF增加到相當(dāng)高的濃度時(shí)就引發(fā)一系列變化。(二)細(xì)胞周期蛋白(dànbái)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控1.G1期周期蛋白正常情況下，哺乳動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞的G1期后期具有一個(gè)控制樣的限制點(diǎn)，稱(chēng)為G1控制點(diǎn)。人類(lèi)細(xì)胞在G-期表達(dá)3種周期蛋白：

第三十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt

CyclinC、D和E。處于Go期的細(xì)胞受生長(zhǎng)因子刺激后，首先表達(dá)C、D型周期蛋白，再表達(dá)E型周期蛋白，然后進(jìn)入DNA合成期。CyclinC的水平在G0期稍有增加(zēngjiā)，在細(xì)胞周期的其他時(shí)期內(nèi)波動(dòng)很小。CyclinD在不斷增殖的細(xì)胞中的水平波動(dòng)不明顯。CyclinD的表達(dá)對(duì)生長(zhǎng)因子有明顯的依賴(lài)性。在G0早期，D型周期素開(kāi)始表達(dá)，并與CDK4為主的數(shù)種激酶結(jié)合，在細(xì)胞由Go期進(jìn)入Gl的過(guò)程中起重要作用。如果抑制CyclinD在G0期的表達(dá)，細(xì)胞將不能進(jìn)入s期。第三十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt

CyclinE的表達(dá)時(shí)間比CyclinD晚，在細(xì)胞內(nèi)呈周期性表達(dá)，峰值在G1-S過(guò)渡點(diǎn)，在控制(kòngzhì)細(xì)胞由G1期進(jìn)人S期起限速作用。當(dāng)人類(lèi)CyclinE在人包皮成纖維細(xì)胞中穩(wěn)定地過(guò)渡表達(dá)時(shí)，可以縮短被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的G1間期，細(xì)胞在較小的狀態(tài)通過(guò)G1-S期過(guò)渡點(diǎn)，并可減少由G1向S期過(guò)渡時(shí)血清的需要量，而CyclinE在周期中產(chǎn)生的時(shí)間并未改變；但是，由于細(xì)胞提前進(jìn)入S期，影響了為復(fù)制DNA所需要的因子的積累，縮短的G1期的時(shí)間由延長(zhǎng)s期和G2期得以補(bǔ)差平衡。由此可見(jiàn)，CyclinE的合成程度是細(xì)胞G1-S過(guò)渡的限制因素。第三十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt2．S期和M期的周期蛋白(1)CyclinA和CyclinB。CyclinA的合成(héchéng)早于CyclinB，它的合成(héchéng)起始接近于Gl-S期過(guò)渡點(diǎn)，并在間期就進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。破壞CyclinA的功能將抑制染色體的復(fù)制。CyclinB的合成(héchéng)起始于S期，在G2-M期過(guò)渡中逐漸增加，直至有絲分裂中期和后期之間發(fā)生驟然降解。而且，CyclinB在核膜破裂前才進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。CyclinA和CyclinB分別與CDK2和CDKl相結(jié)合，使細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期。第三十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt

(2)CyclinH。CyclinH與一種與CDK相關(guān)的激酶M015相結(jié)合，M015-CyclinH復(fù)合物能增強(qiáng)CDK2-CyclinA的激酶活性。因此，與其他已知的CDK—Cyclin復(fù)合物不同，MOl5一CyclinH復(fù)合物不是細(xì)胞周期次級(jí)反應(yīng)中的有關(guān)成分，而是中心調(diào)控體系本身，提示細(xì)胞周期中心調(diào)控機(jī)制(jīzhì)中存在Cyclin—CDK的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。第三十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt第三十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt第三十七頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt第三十八頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt第三節(jié)細(xì)胞增殖與腫瘤人類(lèi)腫瘤的發(fā)生與癌基因激活和抑癌基因失活有關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)，癌基因和抑癌基因作用的歸結(jié)點(diǎn)在于對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控多表現(xiàn)為起正調(diào)控作用的Cyclin過(guò)度表達(dá)，而發(fā)揮(fāhuī)負(fù)調(diào)控作用的抑制因子CKI卻常常失活。如在多數(shù)惡性腫瘤中都有CyclinD的過(guò)度表達(dá)或/和P21、P27低表達(dá)。細(xì)胞周期的監(jiān)測(cè)點(diǎn)異常也可能導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂而癌變。特別是約半數(shù)以上惡性腫瘤中有分子警察P53的突變。第三十九頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt

第四節(jié)細(xì)胞增殖常用的檢查方法

1.細(xì)胞核分裂計(jì)數(shù)核分裂象是細(xì)胞周期中惟一可以用形態(tài)學(xué)方法識(shí)別的時(shí)期(shíqī)，在普通光學(xué)顯微鏡下即能夠進(jìn)行。Baak提出核分裂的識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)的為：核膜消失；在核分裂中央缺乏透明區(qū)；核分裂象兩側(cè)或外周可見(jiàn)毛發(fā)樣突起；胞漿嗜堿性。核分裂計(jì)數(shù)有高倍視野法(highpowerfields，HPF)和核分裂指數(shù)法(mitoticindex，MI)。

第四十頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt

高倍視野法在高倍(×400)下，隨機(jī)選擇多個(gè)視野(≥10)，分別觀察并計(jì)數(shù)其中(qízhōng)的核分裂象，然后計(jì)算出每個(gè)HPF中核分裂象的平均值。由于不同型號(hào)的顯微鏡HPF的面積太小可能存在一定差異，且所測(cè)細(xì)胞的大小不同，單位面積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)亦不相同，該方法存在結(jié)果可比性和重復(fù)性較差的問(wèn)題。第四十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt核分裂指數(shù)法:在目鏡上加一單線狀標(biāo)尺，計(jì)數(shù)高倍(×400)視野下與標(biāo)尺相交的細(xì)胞數(shù)(n)，該視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)A=π(n／2)2。計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，其中(qízhōng)第1、5、10視野按上述公式計(jì)算，3個(gè)視野細(xì)胞數(shù)之和除以3，乘以10，則為10個(gè)視野的細(xì)胞總數(shù)。以10個(gè)高倍視野的核分裂象數(shù)除以細(xì)胞總數(shù)，求得MI值。第四十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt第四十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt第四十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt第四十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt在不同腫瘤中，核分裂數(shù)多少的意義(yìyì)是不一樣的。如：胃腸道平滑肌腫瘤：≤5/10HPF；良性或潛在惡性≥5/10HPF：惡性子宮平滑肌腫瘤：≥10/10HPF+異型性+腫瘤性壞死：惡性≥10/10HPF、無(wú)異型性、無(wú)壞死：潛在惡性胃腸道間質(zhì)瘤：5/50HPF+腫瘤＞5cm：惡性第四十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt2.DNA合成情況的檢測(cè)(jiǎncè)直接反映處于S期細(xì)胞的多少。可通過(guò)測(cè)定標(biāo)記的DNA前體物質(zhì)，如3H-去氧胸腺嘧啶核苷，或核苷酸類(lèi)似物質(zhì)5-溴-2脫氧尿苷（Bromodeoxyoridine,BrdU),應(yīng)用放射自顯影、免疫組化或閃爍測(cè)定儀、流式細(xì)胞儀定性或定量測(cè)定標(biāo)記的細(xì)胞術(shù)。第四十七頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt3H標(biāo)記胸腺嘧啶(mìdìnɡ)脫氧核苷摻人標(biāo)記技術(shù)

3H標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷摻人標(biāo)記技術(shù)(thymidinelabeling,3H-TdR)由Johnson等于1961年首次建立，是顯示s期細(xì)胞的經(jīng)典方法。用活細(xì)胞或新鮮組織與3H標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷孵育1～2h，有DNA合成能力的s期細(xì)胞將攝人3H—TdR合成新的DNA，通過(guò)放射自顯影顯示，可在顯微鏡下直接辨認(rèn)s期細(xì)胞，計(jì)數(shù)全部細(xì)胞中s期細(xì)胞的百分率作為胸腺嘧啶脫氧核苷標(biāo)記指數(shù)(thymidinelabelingindex，TLI)表示增殖活性。第四十八頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt操作步驟a.剪碎的無(wú)菌新鮮組織或體外培養(yǎng)細(xì)胞加入培養(yǎng)基和3H標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h；b．集組織和細(xì)胞，PBS清洗后，10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片；c.室內(nèi)將脫蠟水化后的切片浸人感光乳膠(rǔjiāo)，然后在4℃的暗盒內(nèi)曝光3天；d.在暗室內(nèi)放射自顯影的切片在顯影液中顯影，然后在定影液中定影；e.切片經(jīng)蘇木素伊紅染色；f.計(jì)數(shù)2000～5000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，求得TLI。第四十九頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt應(yīng)用:

3H-TdR標(biāo)記技術(shù)自建立以來(lái)，已得到廣泛應(yīng)用。Iinden研究證實(shí)高TLI與乳腺癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)、病理(bìnglǐ)分型及臨床亞型有關(guān)，與其他預(yù)后指標(biāo)相比，TLI是最有價(jià)值的。存在的問(wèn)題:TLI只顯示s期細(xì)胞數(shù)量，而未顯示s期長(zhǎng)短，因而可能出現(xiàn)細(xì)胞增殖速度慢而TLI增高的情況

第五十頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt由于腫瘤生長(zhǎng)的異質(zhì)性，對(duì)腫瘤組織取材的代表性不夠亦會(huì)造成結(jié)果偏差；觀察者的經(jīng)驗(yàn)、計(jì)數(shù)細(xì)胞的多少、組織的新鮮程度以及放射性同位素的活性均可影響結(jié)果的可靠性；需要新鮮組織及放射性同位素是TLI應(yīng)用受限的主要(zhǔyào)原因。第五十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt溴脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記技術(shù)溴脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記技術(shù)(5-bromodeoyuridine，Brdu)由于3H-TdR標(biāo)記技術(shù)需要同位素，推廣受限。5一溴脫氧尿嘧啶核苷(5一bromodeoyuridine，Brdu)是胸腺嘧啶核苷的相似物，像胸腺嘧啶脫氧核苷一樣可摻人到細(xì)胞(xìbāo)合成的DNA中，摻人到細(xì)胞(xìbāo)DNA的Brdu可通過(guò)抗5一Brdu單克隆抗體在組織切片和細(xì)胞(xìbāo)爬片上顯示或通過(guò)FCM檢測(cè)s期細(xì)胞(xìbāo)。第五十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt操作步驟a.剪成0.5mm3大小的無(wú)菌新鮮組織或體外培養(yǎng)細(xì)胞加入含Brdu的培養(yǎng)基，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h；2.集組織和細(xì)胞，用PBS清洗后，70％乙醇固定，常規(guī)石蠟包埋切片；c.切片脫蠟水化，3％H202阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20min，蒸餾水洗；d.0.1NNaCl于4℃處理5min，再用90％的甲酰胺水溶液58℃孵育30min，以變性DNA；e.4℃預(yù)冷的PBS清洗2min，以停止DNA變性；f.利用抗Brdu抗體，按免疫組織化學(xué)方法染色；g.蘇木素襯染；h.計(jì)數(shù)2000～5000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，求得標(biāo)記(biāojì)指數(shù)LI。第五十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt應(yīng)用1982年，Gratzner等首先利用抗5-Brdu和抗5一碘脫氧尿啼啶核苷單克隆抗體顯示DNA復(fù)制，與用3H-TdR標(biāo)記法所獲結(jié)果一致。隨后該方法得到廣泛應(yīng)用，獲得滿意結(jié)果，認(rèn)為此法能對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行迅速而穩(wěn)定的測(cè)量。

存在的問(wèn)題Brdu標(biāo)記技術(shù)雖然不用(bùyòng)放射性同位素，但仍需要新鮮組織；組織或細(xì)胞的離體時(shí)間、Brdu濃度是影響結(jié)果的重要參數(shù)。離體時(shí)間超過(guò)15min將嚴(yán)重影響結(jié)果的可靠性。第五十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt3.細(xì)胞核仁組成區(qū)嗜銀相關(guān)蛋白（AgNOR)概述：核仁組成區(qū)（Nucleolusorganizerregion,NORs)位于核仁rDNA袢，由rDNA、rRNA組蛋白、非組蛋白等組成。參與蛋白質(zhì)、核糖體合成及核仁組成。NORs的酸性非組蛋白又稱(chēng)為核仁組成區(qū)相關(guān)蛋白，能與Ag結(jié)合(jiéhé)并被還原為氧化銀沉淀，故稱(chēng)為核仁組成區(qū)嗜銀相關(guān)蛋白（AgNOR)。常用明膠液和硝酸銀等作為染色劑?？捎迷谑炃衅蚣?xì)胞涂片中，應(yīng)用廣泛。是常用的檢測(cè)細(xì)胞增殖活性方法。第五十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt細(xì)胞核內(nèi)AgNOR數(shù)目反映：核仁內(nèi)rDNA的轉(zhuǎn)錄活性水平；在染色體組中NOR染色體的數(shù)目，及細(xì)胞分裂周期中所處的階段。組織切片中AgNOR平均計(jì)數(shù)(jìshù)增加的原因：（1）細(xì)胞增殖活躍，以致細(xì)胞核內(nèi)核仁分解，AgNOR分散于細(xì)胞核中（2）核仁融合缺陷，使AgNOR分散（3）細(xì)胞的染色體倍體數(shù)增加（4）rDNA轉(zhuǎn)錄活性增加第五十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt染色方法NORs的染色方法很多，有銀染一步法、火棉薄膜覆蓋法、PEG法、雙重染色法和鉍染法等，應(yīng)用最廣的還是銀染一步法。HoweU銀染一步法1．切片的制備手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本，lO％甲醛溶液(福爾馬林)固定，常規(guī)石蠟包埋，作連續(xù)4gm切片。2．膠質(zhì)銀工作液配制將明膠溶于1％甲酸液使其成為2％溶液(即2克明膠溶于100ml1％甲酸液中)，將此液按1：2容積比與50％硝酸銀混合即成。3．染色(1)切片常規(guī)脫蠟至去離子水水化。(2)暗室內(nèi)(shìnèi)，室溫(20~25C)下滴加膠質(zhì)銀工作液覆蓋切片表面，一般以27—60分鐘為宜。(3)流水充分沖洗切片(4)對(duì)比染色(中性紅蘇木素或甲基綠等)。(5)常規(guī)脫水透明封片4．結(jié)果切片背景為淺黃色，AgNOR顆粒為深棕色。第五十七頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt固定劑的選擇由于AgNOR技術(shù)在組織病理學(xué)上的應(yīng)用日益廣泛，Smith等(1988)及時(shí)(jíshí)研究了一系列固定劑對(duì)AgNOR的影響。他們發(fā)現(xiàn)乙醇類(lèi)固定劑效果最佳，10％甲醛溶液固定劑效果是滿意的，10％中性甲醛溶液的效果接近于乙醇類(lèi)固定劑。一般說(shuō)來(lái)，可選用的固定液為：乙醇、丙酮、10％甲醛溶液、10％中性甲醛溶液，Carnoy’s固定液、Clark’s固定液。不應(yīng)選用的固定液為：升汞甲醛溶液、Helly’S固定液、Zenker’s固定液、戊二醛／苦味酸固定液。第五十八頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選pptAgNOR的形態(tài)分型:1.單一型為境界清楚邊緣光滑的圓形顆粒,顆粒周?chē)Ｓ幸豢諘?顆粒位于核中央或偏位,此型在良性病變中多見(jiàn)2．彌散型在核漿內(nèi)散在分布、大小不一的顆粒。數(shù)目一般可多達(dá)10～20個(gè)，甚至更多。顆粒形態(tài)可為圓點(diǎn)狀、條塊狀或不規(guī)則形，有時(shí)亦可見(jiàn)相互重疊的現(xiàn)象(xiànxiàng)。此型在惡性腫瘤中多見(jiàn)。3．聚集型耷核漿內(nèi)散在分布大小不一的顆粒，顆粒常聚集成團(tuán)塊狀、條索狀或不規(guī)則形，無(wú)法明確計(jì)數(shù)。4．核仁內(nèi)型胞核內(nèi)有一個(gè)或數(shù)個(gè)核仁，核仁大小不一，大者直徑可達(dá)2．5～6扯m，核仁周邊常有空暈。每個(gè)核仁內(nèi)有境界清晰或不清晰的顆粒，數(shù)量不等。5．混合型上述各型均可相互混合，混合所占的比例大致相同。

第五十九頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選ppt計(jì)數(shù)方法:為了便于與修改后的標(biāo)準(zhǔn)化方案比較，1993年的“上海方案”的計(jì)數(shù)原則如下：，1．每例涂片至少計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，切片至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)每一個(gè)可辨別的顆粒。2．直徑≥2．5μm的團(tuán)塊或顆粒按5個(gè)顆粒計(jì)算(jìsuàn)。3．最后按單位細(xì)胞核內(nèi)的．AgNOR數(shù)計(jì)算。4．除計(jì)數(shù)外，尚須注明形態(tài)分型。AgNOR顆粒形態(tài)的觀察與計(jì)數(shù)同樣重要，特別是病變介于良惡性之間或細(xì)胞增生活躍者更應(yīng)注意顆粒形態(tài)類(lèi)型。第六十頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選pptFigure1.Silver-stainedHodgkin'sandReed-SternbergcellsinlymphnodeimprintsfromapatientwithHodgkin'sdisease(originalmagnificationx1000).

第六十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。精選pptFig3A-B.Highpowerfieldofsilverstainedpreparationof(A)parostealand