測定糖化酶活性的方法

關(guān)于測定糖化酶活性的方法第1頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶,糖化酶是一種習(xí)慣上的名稱，學(xué)名為α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4-Glucanglucohydrolace)。多應(yīng)用于酒精、淀粉糖、味精、抗菌素、檸檬酸、啤酒等工業(yè)以及白酒、黃酒。糖化酶是由曲霉優(yōu)良菌種（Aspergilusniger）經(jīng)深層發(fā)酵提煉而成。糖化酶是食品工業(yè)中常用的一種酶。第2頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是從淀粉、糊精、糖原等碳鏈上的非還原性末端（整個碳鏈只有一個還原端，與之相對的都是非還原端）依次水解a-1,4糖苷鍵,切下一個個葡萄糖單元，并像β-淀粉酶一樣,使水解下來的葡萄糖發(fā)生構(gòu)型變化，形成β-D-葡萄糖。對于支鏈淀粉，當(dāng)遇到分支點時，它也可以水解a-1,6糖苷鍵，由此將支鏈淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a-1,3連接的碳鏈，但水解a-1,4糖苷鍵的速度最快，它一般都能將淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。第3頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三酶活測定方法

測定糖化酶的方法有次碘酸鈉法、蘭–愛農(nóng)法（ＳＰ法）、Schoorl法（ＤＵ法）和對硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）、3,5-二硝基水楊酸(DNS)等方法。

我們采用次碘酸鈉法來測定糖化酶的活性。第4頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三糖化酶以可溶性淀粉為底物在一定條件下（pH范圍是4～6,溫度范圍是40～60℃）進(jìn)行反應(yīng)，生成的葡萄糖用次碘酸鈉法定量測定。以單位時間內(nèi)分解α–１，４糖苷鍵生成葡萄糖所需的酶量為酶的活力單位。次碘酸鈉法：碘與NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地(1:1)被NaIO氧化在酸性條件下，未與C6H12O6

作用的NaIO可轉(zhuǎn)變成I2

析出,因此只要用Na2S2O3

標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定析出的I2

，便可計算出未參與反應(yīng)的NaIO，由此推導(dǎo)出糖化酶催化所產(chǎn)生的C6H12O6

的含量。第5頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三具體步驟

1.I2

與NaOH作用:I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2O2.C6H12O6

與NaIO定量作用:C6H12O6+NaIO=C6H12O7+NaI第6頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三3.C6H12O6反應(yīng)完后,剩余的NaIO在堿性條件下發(fā)生歧化反應(yīng):3NaIO=NaIO3+2NaI4.歧化產(chǎn)物在酸性條件下進(jìn)一步作用生成I2:NaIO3+5NaI+6H2SO4=3I2+6Na2SO4+3H2O5.析出的I2

可用標(biāo)準(zhǔn)Na2S2O3

溶液滴定之:I2+2Na2S2O3=Na2S4O6+2NaI第7頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三注：在這一系列的反應(yīng)中，1mol葡萄糖與1molNaIO作用，而1molI2產(chǎn)生1molNaIO，因此，1mol葡萄糖與1molI2

相當(dāng)。只要得出對照組和實驗組所消耗的硫代硫酸鈉體積，兩者相減就可以得出與葡萄糖反應(yīng)的那部分次碘酸鈉的量，從而可以確定酶解生成的葡萄糖的量，從而計算出酶活。第8頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三對照組實驗組I2NaIONaIO另一部分歧化反應(yīng)生成NaIO3NaIO一部分與葡萄糖反應(yīng)I2I2NaIONaIO3I2完全歧化反應(yīng)，無葡萄糖第9頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三試劑與器材1.糖化酶試劑；2.微量滴定管、滴定臺、試劑瓶、試管、三角瓶、pH計、電子天平；3.試劑

2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋酸緩沖液；0.1mol/L碘液；0.1mol/L氫氧化鈉溶液；2mol/L硫酸溶液；0.1N硫代硫酸鈉溶液；0.5%淀粉指示劑。第10頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三操作步驟1.取7個帶塞的試管（其中3個測今年批次的酶活、另外3個測去年批次的酶活、1個作空白對照），分別吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸緩沖液2.5ml，混勻后于40℃水浴中預(yù)熱10min。2.加入酶液0.5ml（空白對照組以煮沸失活的酶液代替）于40℃，反應(yīng)10min；反應(yīng)結(jié)束時，立即于沸水浴加熱5min使酶失活(此時應(yīng)將試管的塞子打開）。第11頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三3.取上述反應(yīng)液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液5ml，緩慢加入0.1mol/LNaOH溶液5ml(注意:加堿速度不能過快,否則過量NaIO來不及氧化C6H12O6

而歧化為不與C6H12O6反應(yīng)的NaIO3

和NaI,使測定結(jié)果偏低)，搖勻后在暗處放置15min后加入2mol/L硫酸2ml；4.以0.5%可溶性淀粉為指示劑（4-5滴即可），用0.1N硫代硫酸鈉溶液滴定至藍(lán)色消失為終點。記錄0.1N硫代硫酸鈉消耗的毫升數(shù)：酶液樣品（A）、空白對照（B）；第12頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三

計算

(1)在上述條件下，1ml酶液每小時催化2%淀粉溶液生成1mg葡萄糖的酶量定義為1個酶活力單位：

酶活力單位（U/ml）=（B－A）×（N/2）×180.1×（8/5）×2×（60/10）式中:B——空白滴定消耗的硫代硫酸鈉毫升（ml）數(shù)；

A——酶液滴定消耗的硫代硫酸鈉毫升（ml）數(shù)（取3次滴定的平均值）；

N——硫代硫酸鈉的當(dāng)量濃度。

180.1——葡萄糖的摩爾質(zhì)量。

8/5——表示從8ml酶反應(yīng)體系取出5ml反應(yīng)液。

2——所加酶液為0.5ml，按定義為1ml。

60/10——表示酶反應(yīng)時間為10min，按定義為1h。第13頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三（2）在上述條件下，1ml酶液每分鐘催化2%淀粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定義為1個酶活力單位（U）：酶活力單位（U/ml）=（B－A）×10-3×（N/2）×（8/5）×106×2

×（1/10）式中符號與前式相同，其中：

10-3——ml換算成L。

106——μmol換算成mol。第14頁，講稿共16頁，2023年5月2日，星期三反應(yīng)試劑配制方法（1）2%可溶性淀粉稱取可溶性淀粉2g（預(yù)先100℃烘干約2h至恒重），用少量蒸餾水調(diào)勻，徐徐傾入巳沸的蒸餾水中，煮沸至透明，冷卻定容至l00ml，此溶液需當(dāng)天配制。

（2）0.2mol/LpH4.6醋酸鈉緩沖液稱取醋酸鈉(CH3COONa·3H2O)2.722g，用蒸餾水溶解，定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH)1.17m1定容至100ml。分別取醋酸鈉49ml和醋酸51ml混勻。緩沖液以酸度計或精密試紙校正pH。

（3）0.1mol/L碘液稱取13g