生化技術(shù)固定化的酶與微生物

關(guān)于生化技術(shù)固定化的酶與微生物第1頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三

一、固定化的酶與固定化微生物的概念

第2頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三是一類由生物細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化功能的生物大分子（蛋白質(zhì)），通常稱作生物催化劑酶:第3頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三固定化酶(inmobilizedenzyme)

是用適當(dāng)?shù)奈锢怼⒒瘜W(xué)方法把純化的酶固定于一定的空間內(nèi)，使其成為既保持了本身的特性，又能在連續(xù)反應(yīng)之后可以回收和重復(fù)使用的一種制品

第4頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三

是用適當(dāng)?shù)奈锢?、化學(xué)方法把純化的微生物固定于一定的空間內(nèi)，使其成為既保持了本身的特性，又能在連續(xù)反應(yīng)之后可以回收和重復(fù)使用的一種制品

固定化微生物第5頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三固定化酶和固定化微生物的研究歷史:1916年Nelson和Griffin發(fā)現(xiàn):有些酶雖然不溶于水，但是仍存在催化活性現(xiàn)象1953年Grubhofer和Schleith真正開始固定化酶的研究1960年之后，Katzir-Katchalski學(xué)派對(duì)酶的固定方法和固定化酶的理化性質(zhì)做了大量的工作，并將其成功地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)1969年千煙一郎也成功地將固定化氨基?；笐?yīng)用于DL-氨基酸的光學(xué)拆分過程，使其反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了連續(xù)化1973年千煙一郎研制成了大腸桿菌(E．coli)的固定化細(xì)胞，即所謂固定化微生物，并將其用于連續(xù)生產(chǎn)L-天門冬氨酸過程。第6頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三

固定化微生物雖然僅較適用于催化小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，并伴隨發(fā)生分解生成物等副反應(yīng)，但它工序簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、酶活力喪失少、成本低廉，以及利用其固有的多酶系統(tǒng)可對(duì)有機(jī)體的代謝途徑進(jìn)行研究固定化微生物的特點(diǎn):

本章將就固定化的酶與微生物的制備方法及其制品的性質(zhì)和應(yīng)用進(jìn)行討論

第7頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、固定化酶的制備第8頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三（一）酶固定化的前提條件

酶的活性中心(催化部分)和空間結(jié)構(gòu)(結(jié)合部分)的維持是其具有催化活力的必需條件。因此，在制備固定化酶時(shí)，要盡可能避免采用劇烈的條件（過高的溫度和鹽濃度、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿，以及各種有機(jī)溶劑等）處理。否則，酶的催化作用會(huì)降低，甚至喪失，或者改變酶對(duì)底物的專一性

第9頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三

（二）酶的固定化方法

固定化酶制備方法，根據(jù)制備原理分類：第10頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三制備固定化酶的模式圖：

第11頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三1．載體結(jié)合法(1)物理吸附法

載體類型：是將酶蛋白吸附到水不溶性的惰性載體上制成固定化酶的過程。制備原理：常為疏松多孔的吸附材料；如：多孔玻璃、活性炭、酸性白土、羥基磷灰石、磷酸鈣凝膠以及淀粉等物質(zhì)。酶與載體的相互作用較弱，二者之間易于分離。缺點(diǎn)：酶活力不易喪失，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)不發(fā)生明顯變化。優(yōu)點(diǎn)：第12頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三(2)離子結(jié)合法

載體類型：將酶以離子結(jié)合的方式固定到具有離子交換基團(tuán)的非水溶性載體上制成的固定化酶。制備原理：常為帶各種離子基團(tuán)的硅膠、纖維素、交聯(lián)葡聚糖和樹脂等物質(zhì)。酶與載體的結(jié)合力不高，且易受緩沖液類型和pH值高低的影響。應(yīng)用這種固定化酶反應(yīng)時(shí)，溶液的pH值、離子強(qiáng)度、溫度和底物濃度發(fā)生變化，往往可引起酶的脫落。

。缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：操作較簡(jiǎn)便、條件較溫和、酶活力不易喪失。第13頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三(3)共價(jià)結(jié)合法

是將酶的非必需基團(tuán)(α-氨基，ε-氨基，α、β、γ-羧基，羥基，咪唑基等)通過共價(jià)鍵或整合劑偶聯(lián)于固相載體上而制成固定化酶。制備原理：有硅膠、纖維素、瓊脂糖和交聯(lián)葡聚糖，以及聚丙烯酰胺凝膠等物質(zhì)。酶與載體結(jié)合很牢固，使用周期長(zhǎng)（該法目前應(yīng)用較為普遍）。優(yōu)點(diǎn)：載體類型:操作較復(fù)雜、條件較劇烈、酶活力喪失較多。缺點(diǎn)：第14頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三根據(jù)偶聯(lián)反應(yīng)方式類型的不同，可將共價(jià)結(jié)合法分為：共價(jià)結(jié)合法重氮法多肽法烷化法縮合劑法載體交聯(lián)法疊氮法鹵化氰法載體共價(jià)交聯(lián)法“酶網(wǎng)’’載體法第15頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三●重氮法制備原理：常用載體:先將載體（帶氨基的芳香族化合物R-Y-NH2）用稀鹽酸和亞硝酸鈉（相當(dāng)于亞硝酸）處理生成重氮鹽化合物，然后與酶蛋白的酚基、咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)(游離氨基也能發(fā)生十分緩慢的反應(yīng))，制成固定化酶（形成偶氮化合物）有對(duì)氨芐基纖維素、聚氨基聚苯乙烯、3-對(duì)-氨苯氧基-2-羥丙酰纖維素、氨基酸共聚物、交聯(lián)葡聚糖-氨茴香酸酯等弱酸性環(huán)境加入酶蛋白，低溫（0~5℃）第16頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三●多肽法

利用肽的合成原理，使酶蛋白和載體之間以肽鍵連接而制成固定化酶的過程。它又分疊氮法和鹵化氰法等第17頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三◆疊氮法先用羧甲基纖維素甲酯與水合肼作用形成酰肼，然后再與亞硝酸反應(yīng)得到疊氮化合物，再在低溫條件下，該化合物和酶的游離-NH2、-OH和-SH反應(yīng)形成肽鍵，即偶聯(lián)成固定化酶◆鹵化氰法此法與第七章“親和層析”中親和吸附劑的制備原理相似。先用鹵化氰(常用的是溴化氰CNBr)活化纖維素、交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖等多糖類載體，然后在偏堿性環(huán)境條件下，使載體（基質(zhì)）與酶（配體）進(jìn)行偶聯(lián)，即可制成固定化酶

第18頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三●烷基化法制備原理：常用載體:利用蛋白質(zhì)N末端游離-NH2、Tyr的Ph–OH、Cys的–OH等與含鹵族功能團(tuán)的非水溶性載體發(fā)生烷基化反應(yīng)（由酶蛋白取代鹵族功能團(tuán)）制成固定化酶氯乙酰纖維素、溴乙酰纖維素、碘乙酰纖維素、聚乙二醇碘乙酰纖維素和二氯-S-三嗪基纖維素等。其中二氯-S-三嗪基纖維素是帶正電荷的，它對(duì)中性或堿性的酶蛋白、或作用于帶負(fù)電荷底物的酶蛋白進(jìn)行固定化較為有利，用其制備的固定化酶活力較高。第19頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三●縮合劑法

將酶（含-COOH和-NH2）與含-NH2和-COOH的載體（R-NH2

或R-COOH）在縮合劑碳化二亞胺（R1-N=C=N-R2）或伍德沃德試劑K(N-乙基-5-苯異口惡唑-3′-磺酸)作用下進(jìn)行縮合反應(yīng)，制成固定化酶制備方法：第20頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三●載體交聯(lián)法

這種制備固定化酶的方法有的地方把它歸到交聯(lián)法。因?yàn)樗鼈兌际峭ㄟ^一個(gè)中間工具“交聯(lián)劑”（如戊二醛等）將酶固定化的。載體交聯(lián)法是在酶與載體之間進(jìn)行交聯(lián)，使酶固定化；而交聯(lián)法是在酶分子與酶分子之間進(jìn)行交聯(lián)，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶第21頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、交聯(lián)法

交聯(lián)法是酶分子之間在雙功能基團(tuán)交聯(lián)劑作用下，相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶過程。最常用的交聯(lián)劑是戊二醛，它和酶蛋白中的游離氨基形成希夫氏(Schiff)堿，從而使酶分子之間相互交聯(lián)成固定化酶。

此外，順丁烯二酸酐或乙烯共聚物與酶分子在六甲撐二氨作用下，相互間進(jìn)行反應(yīng)，亦可制成固定化酶第22頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三3、包埋法定義：就是將酶包裹到高分子凝膠等物質(zhì)的細(xì)微網(wǎng)格中，或包埋到高分子半透膜中制成固定化酶的方法

分類：包埋法根據(jù)包埋分式不同分為網(wǎng)格型和微囊型由于包埋法制備固定化酶的過程中，酶本身不發(fā)生物理化學(xué)變化，故其活力回收率較高，適用于固定各種類型的酶。目前應(yīng)用較多的是格子型包埋法，此法所用的材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、天然瓊脂糖和淀粉等，用其制備固定化酶的操作簡(jiǎn)單這種固定化酶制品只能應(yīng)用于底物和產(chǎn)物的分子質(zhì)量都小的反應(yīng)中優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：第23頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三第24頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三四、固定化微生物的制備

目前，固定化微生物的制備方法最多的是包埋法，其次是載體結(jié)合法和交聯(lián)法；另外，還有用選擇性熱變法制備固定化微生物的，就是將細(xì)胞在適當(dāng)溫度下進(jìn)行處理，使細(xì)胞膜蛋白變性，但不使酶變性而使酶固定與細(xì)胞內(nèi)的方法第25頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三

采用包埋法制備的部分固定化微生物及其用途第26頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三五、固定化酶和固定化微生物的性質(zhì)第27頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三（一）相對(duì)活性固定化酶(或微生物)的活力，通常用“相對(duì)活力”表示以固定化酶(或微生物)的活力與同樣量游離酶活力之比稱為相對(duì)活力；一般用百分?jǐn)?shù)表示。以游離酶(或微生物)的活力為100作比較

●概念：一般，酶固定化以后，其活性通常會(huì)有不同程度的下降第28頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三

●酶固定化以后，活性降低的原因：（1）酶蛋白空間構(gòu)象改變，空間位阻效應(yīng)增加，而酶的催化活性與其特定的空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)；尤其是共價(jià)結(jié)合法和交聯(lián)法（酶的活性基團(tuán)參與反應(yīng)）對(duì)空間結(jié)構(gòu)的影響更大（2）酶與載體偶聯(lián)后產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)降低了酶分子周圍的底物濃度，減少了酶與底物接觸的機(jī)會(huì)；使反應(yīng)減慢，表現(xiàn)出酶活力下降（3）包埋法中凝膠通透性的影響，使酶與底物的接觸受到限制

另外，有些固定化酶(或微生物)相對(duì)活力的大小，還會(huì)受到底物與載體性質(zhì)、酶的類型、酶量以及制備方法等因素的影響第29頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三第30頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三

（二）活力曲線與最適pH值

固定化酶(或微生物)的活力曲線與最適pH值的變化：酶(或微生物)固定化后，其活力曲線和最適pH值，一般會(huì)發(fā)生偏移活力曲線和最適pH值偏移的原因：①酶固定化后，部分氨基酸側(cè)鏈和酶分子的凈電荷發(fā)生了改變，隨之酶活性基團(tuán)的解離值(pK)也改變；而酶的活性與其解離狀態(tài)相關(guān)；②由于載體的理化性質(zhì)受到影響，致使固定化酶顆粒擴(kuò)散層內(nèi)外的[H+]濃度產(chǎn)生差異，其中多陰離子衍生物載體帶負(fù)電荷，最適pH值向堿側(cè)偏移，而多陽(yáng)離子衍生物載體帶正電荷，最適pH值則向酸側(cè)偏移；③酶反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)致固定化酶顆粒內(nèi)帶電微環(huán)境的改變（在大多數(shù)情況下，固定化酶的活力曲線要比游離酶陡峭）第31頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三②的解釋：

在固定化酶反應(yīng)體系中，酶顆粒周圍存在一個(gè)極薄的擴(kuò)散層，帶電的載體使固定化酶微環(huán)境中的帶電狀態(tài)不同與外環(huán)境。帶負(fù)電荷的載體會(huì)使料液中H+局部集中于擴(kuò)散層，使固定化酶微環(huán)境的PH值低于外側(cè)料液的PH值；為了抵消這種影響，需提高料液的PH值，才能使固定化酶達(dá)到最大的催化速度；所以，帶負(fù)電荷的載體通常使固定化酶的最適PH值向堿側(cè)偏移，而帶正電荷的載體則通常使固定化酶的最適PH值向酸側(cè)偏移第32頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三活力曲線和最適pH值偏移的表現(xiàn)第33頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三

綜上情況可以看出，酶(或微生物)經(jīng)固定化后，其活力曲線和最適pH的變化是有一定規(guī)律的。因此，當(dāng)酶的最適pH與其所處的環(huán)境pH不相同時(shí)，可通過選擇適當(dāng)?shù)妮d體進(jìn)行固定，以改變其最適p值，使之與環(huán)境相一致，從而使固定化酶活力達(dá)到最大。第34頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三

特點(diǎn)：①固定化酶的穩(wěn)定性一般都優(yōu)于游離酶；②固定化微生物的穩(wěn)定性，基本上與固定化酶相近。

固定化酶穩(wěn)定性提高的原因可能是：帶電荷載體與酶分子之間產(chǎn)生了靜電作用，對(duì)酶的特定空間構(gòu)象起到穩(wěn)定作用蛋白水解酶在固定化后避免了酶自身的消化現(xiàn)象發(fā)生固定化以后，由于空間位阻，降低了變性劑、解離劑、有機(jī)溶劑等對(duì)酶的進(jìn)攻破壞作用（三）穩(wěn)定性第35頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三第36頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三（四）米氏常數(shù)●米氏常數(shù)（K

m）是酶的一個(gè)特征性常數(shù)，每一種酶都有一定的K

m值，其倒數(shù)1/K

m稱為親和常數(shù)，用來(lái)表示酶與底物的親和力；而固定化酶的K

m值和最大反應(yīng)速度（Vm）常因酶蛋白結(jié)構(gòu)的變化和載體帶電荷的影響而變化。此外，隨著反應(yīng)體系離子強(qiáng)度的增大，或者載體粒度的增大，米氏常數(shù)也會(huì)增大。一般，載體的顆粒越小，固定化酶越接近游離狀態(tài)的酶，米氏常數(shù)就越接近?！窆潭ɑ傅淖畲蠓磻?yīng)速度與游離酶相比，要依具體情況而定。大多數(shù)酶經(jīng)固定化以后，Vm

變化不大，但也有由于固定化方法不同而有差異的。如：以多孔玻璃為載體共價(jià)結(jié)合的轉(zhuǎn)化酶，其Vm

與游離酶相同；但用PEAE凝膠包埋的轉(zhuǎn)化酶，其Vm卻只相當(dāng)于游離酶的1/10。第37頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三（五）其他1、PH值的影響：酶用帶正電荷的載體固定時(shí)，在偏酸性環(huán)境條件下可增加固定化酶的穩(wěn)定性；相反，酶用帶負(fù)電荷的載體固定時(shí)，在偏堿性環(huán)境條件下可增加固定化酶的穩(wěn)定性2、酶固定化以后，抗氧化能力增強(qiáng)3、固定化微生物，如含精氨酸脫亞胺酶的惡臭假單包菌，用PEAE凝膠包埋后，由于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其對(duì)底物（S）和產(chǎn)物（P）的選擇性喪失，從而提高了固定化微生物的相對(duì)活力第38頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三六、應(yīng)用

固定化酶(或微生物)比游離酶(或自然微生物)不但穩(wěn)定性好，而且與底物和產(chǎn)物更容易分開，所以在工業(yè)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和生化分析等方面的應(yīng)用發(fā)展較快第39頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三

（一）工業(yè)方面應(yīng)用

由于酶固定化以后，既穩(wěn)定，又容易與S和P分離，并且可以重復(fù)使用；所以固定化酶在工業(yè)上的應(yīng)用既經(jīng)濟(jì)又實(shí)用第40頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三例1、L-氨基酸的生產(chǎn)是利用固定化氨基?；阜磻?yīng)進(jìn)行的生產(chǎn)步驟：先將氨基?；肝接贒EAE-交聯(lián)葡聚糖A-25，制成固定化酶反應(yīng)柱，在柱中通入DL-氨基酸的N-?；苌?，然后采用溶解度法把L-氨基酸和酰化-D-氨基酸分開（這樣就得到了光學(xué)純度好，回首率高的DL-氨基酸）L-苯丙氨酸既是營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，又是甜味劑阿斯巴甜的主原料第41頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三例2、利用固定化多酶反應(yīng)柱生產(chǎn)3-磷酸甘油醛

多酶反應(yīng)柱，從上到下依次分別為用聚丙烯酰胺凝膠包埋的己糖激酶、磷酸己糖異構(gòu)酶、6-磷酸果糖激酶-1、醛縮酶（裂解酶）。當(dāng)向反應(yīng)柱注入一定比例的G、ATP、Mg2+混合時(shí)，這些底物原料流經(jīng)反應(yīng)柱時(shí)，依次被己糖激酶、磷酸己糖異構(gòu)酶、6-磷酸果糖激酶-1和醛縮酶催化反應(yīng)，生成3-磷酸甘油醛第42頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三（二）醫(yī)學(xué)方面

固定化酶在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用，目前正在積極的研究和開發(fā)。其中用包埋法制備的固定化酶，在治療酶缺乏癥和代謝異常癥等疾病時(shí)，有很好的發(fā)展前景。例1在小白鼠腹腔內(nèi)，分別注射生理鹽水、游離的和固定化的天冬酰胺酶后，飼養(yǎng)觀察的結(jié)果如圖10-8所示

※從圖中可看出：使用游離天冬酰胺酶的藥效時(shí)間為2天，而使用固定化天冬酰胺酶的藥效時(shí)間為6天，明顯延長(zhǎng)了藥效時(shí)間第43頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三

※機(jī)體正常的體細(xì)胞能合成足量的Asn供蛋白質(zhì)合成使用，但白血病病變細(xì)胞卻不能合成Asn，必須不斷從血液中攝取Asn供病變細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。因此，臨床上應(yīng)用天冬酰胺酶使Asn水解為Asp，減少血液Asn的含量，使病變細(xì)胞蛋白質(zhì)合成受阻，達(dá)到治療的目的第44頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三例2人工腎

尿毒癥患者就是由于腎臟病變，體內(nèi)的代謝廢物如尿素、尿酸等不能隨尿排出體外，傳統(tǒng)的方法就是“透析”，即利用半透膜將血液中的代謝廢物排除。這種方法病人很痛苦，使用不方便，并且成本很高；而新型人工腎是由微型膠囊脲酶和微型膠囊吸附劑—離子交換樹脂或活性炭構(gòu)成的，將其裝于體外血管分流器內(nèi)，并與循環(huán)系統(tǒng)連接，體積約為1立升，可隨身攜帶。并且由于固定化酶可重復(fù)使用，離子交換樹脂可再生，所以此法比透析法效率高、成本低、使用方便第45頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三（三）生化分析方面

1．定量分析

定量分析是將固定化酶分別與分光光度計(jì)、熒光光度計(jì)和微量熱量計(jì)等儀器組合起來(lái)，進(jìn)行含量檢測(cè)的一種自動(dòng)分析方法。目前這種分析方法正在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。例如，在固定化膽堿酯酶中，通人一定體積的空氣或水，根據(jù)熒光分析測(cè)定結(jié)果，便可得知其中對(duì)人有害的膽堿酯酶神經(jīng)毒劑(酶抑制劑)的含量現(xiàn)在國(guó)際上已用固定化酶對(duì)體液和排泄物中的過氧化氫、尿素、乳酸、葡葡糖和氨基酸等物質(zhì)進(jìn)行自動(dòng)分析測(cè)定(見表10-6)。。第46頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三2．制作酶電極將固定化酶覆蓋在電極上，或?qū)⒚腹潭ㄔ陔姌O上構(gòu)成的裝置稱酶電極，也稱酶?jìng)鞲衅?/p>

3．分析物質(zhì)的結(jié)構(gòu)

將分析蛋白質(zhì)和核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白水解酶、羧肽酶、亮氨酸氨肽酶、核酸酶、磷酸二酯酶和磷酸單酯酶等分別制成固定化酶，在應(yīng)用時(shí)比游離酶操作簡(jiǎn)單，分離方便4．研究酶的功能和反應(yīng)機(jī)理

采用固定化酶可以研究酶的功能和反應(yīng)機(jī)理第47頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三例如為了研究某些酶的亞單位功能，可將具有4個(gè)亞基的醛縮酶固定到瓊脂糖上，制成固定化的醛縮酶(s)。將此酶經(jīng)含巰基乙醇的8mol／L尿素溶液處理后，得到變性的固定化亞單位(b)。然后經(jīng)透析和再生，則分別得到了固定化亞單位(c)和再生固定化醛縮酶(d)(見圖10-9)。(a)、(c)和(d)三者的比活力分別為4.5、1.6和2.2u／mg蛋白。這表明構(gòu)成醛縮酶的亞基(即亞單位)是有酶活性第48頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三5．制備親和吸附劑

有些物質(zhì)如酶和底物(或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑)、抗原和抗體、激素和受體蛋白、DNA和RNA等具有某些生物學(xué)特性，即每一對(duì)物質(zhì)之間存在著很高的特異結(jié)合能力。如果將酶用適當(dāng)?shù)妮d體固定后，制成的親和吸附劑就能把類似底物從混合物中分離出來(lái)。

第49頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三（四）應(yīng)用實(shí)例固定化5′-磷酸二酯酶的制備(重氮法)

材料準(zhǔn)備酶固定化酶活力測(cè)定粗酶液的制備雙功能試劑SESA（對(duì)β-硫酸酯乙砜基苯胺）的配制載體（葡聚糖凝膠G-200

）的制備載體的活化（制備SESA—葡聚糖凝膠G-200載體）原酶液活力測(cè)定

固定化酶活力測(cè)定

殘留酶活力測(cè)定相對(duì)酶活力和回收率的計(jì)算

第50頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、粗酶液制備將桔青霉菌(Penicilliumcitrium)發(fā)酵液用（NH4）2SO4鹽析，或用的冷乙醇沉淀分離得到酶2、雙功能試劑的預(yù)處理

取5gSESA（對(duì)β-硫酸酯乙砜基苯胺）加10ml水研磨，隨后慢慢加入含2％Na2CO3的0.1mol／L的NaOH溶液40ml混勻，收集懸液，棄去殘?jiān)?、載體的處理取10gSephadexG-200(粉末狀150-200目)凝膠，加水200mi浸泡1～2h后，加含2％Na2CO3的0.1mol／LNaOH溶液，室溫放置過夜，使其充分溶脹4、載體的活化將溶脹好的堿性SephadexG-200凝膠置沸水浴中攪拌，當(dāng)加溫到50℃時(shí)，逐漸加入SESA懸液，用含2％Na2CO3的0.1mol／LNaOH溶液調(diào)pH值為8，待加溫到80℃時(shí)，保持20min，爾后繼續(xù)加溫到90℃，維持6min，接著開始降溫冷卻，并依次用0.1mol／LNaOH和0.1mol／LHCL溶液各700ml，洗3次，再用水洗至pH4.0左右

第51頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三5、酶固定化取上述SESA-SephadexG-200載體2g(離心后濕重)于冰浴中冷卻，加5％Na2NO2溶液0．5ml，攪勻并滴加1mol／L

HCL0．5ml，攪拌10min后，用冷的0.05N

HCL洗三次，冷水洗一次。在0～5℃用1mol／LNa2CO3溶液調(diào)pH6.0~7.0，立即加入酶液lml（10mg/ml）,合并洗滌液，用作測(cè)定殘留的酶活力（固定化的5′-磷酸二酯酶呈鮮艷的桔紅色。按此程序，用20m