第章 蛋白質(zhì)的分離純化和表征

Protein第7章

蛋白質(zhì)的分離純化和表征

蛋白質(zhì)含有酸/堿AA殘基具有兩性堿/酸越大——pI越大/越小pI通常在6.0左右一、蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的分子量一般在一萬至一百萬道爾頓之間

二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀（一）根據(jù)化學(xué)組成測定最小分子量1、測定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量2、假設(shè)蛋白質(zhì)中僅含一個(gè)鐵原子最低相對分子質(zhì)量=100*55.8/鐵的百分含量（二）SDS－PAGE測定相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)顆粒電泳時(shí)遷移率取決于：所帶電荷分子量分子形狀十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基極性親水烷基親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）遷移率與電荷和形狀無關(guān)，僅取決于相對分子質(zhì)量巰基乙醇破壞二硫鍵（三饅）凝儀膠過妹濾法挎測定惹相對僅分子臂質(zhì)量蛋白質(zhì)混合樣凝膠乓法只曾適于魚球狀鍛蛋白如分子扁測量三、臺(tái)蛋白送質(zhì)的紫膠體炕性質(zhì)杠與蛋渠白質(zhì)稍的沉牛淀（一酬）膠努體性鎖質(zhì)（co呆ll售oi天da智l很sy將st襲em）膠體尾溶液雅的特殊點(diǎn)：分子記直徑賓在1-罷10岸0升nm內(nèi)質(zhì)點(diǎn)嶄帶有義同種港電荷形成索水化前層,不易除聚集大多耀數(shù)球丘狀蛋幻玉白能帖形成改穩(wěn)定喘的親夸水膠驢體溶凱液（二脂）蛋霧白質(zhì)翁的沉淀Pr從膠點(diǎn)體溶摸液中招析出Ⅰ可逆乘沉淀盞：溫和孝條件喊，改集變?nèi)鼙灰簆H或Pr所帶電寫荷Pr結(jié)構(gòu)系和性馳質(zhì)沒攪有變沸化適當(dāng)蝴條件憶下可表重新狡溶解——非變漿性沉致淀pI沉淀籌法、睜鹽析表法和帖有機(jī)襖溶劑萍沉淀搭法等不可相逆沉不淀強(qiáng)烈劣沉淀舞條件破壞Pr膠體然溶液苗穩(wěn)定眨性也破叨壞Pr結(jié)構(gòu)沉和性冒質(zhì)沉淀洪不能陪再重阻新溶駕解——變性球沉淀如加富熱沉瓜淀、姜強(qiáng)酸/堿沉槽淀、溉重金伴屬鹽和生片物堿拋沉淀爺?shù)娶?.鹽析儲(chǔ)法加入薯中性貌鹽脫隙去蛋謊白質(zhì)歷的水傲化層皆，鹽咽析一爺般不幼引起歉變性2.有機(jī)延溶劑在沉淀脫去他水化腐層以獨(dú)及降可低介聾電常樓數(shù)而趁增加昂帶電告質(zhì)點(diǎn)唉間的射相互絨作用3.等電災(zāi)點(diǎn)沉奧淀4.重金痕屬鹽蠶沉淀與帶霞負(fù)電旁荷蛋極白質(zhì)敬結(jié)成驚不溶烈性鹽5.生物箏堿試庫劑和販某些撥酸類洋沉淀與帶討正電紙荷蛋舊白質(zhì)縣生成仰不溶哄性鹽6.加熱道變性臟沉淀天然塌結(jié)構(gòu)航解體膝，疏積水基砌外露蔽，破壞離水化這層及中帶電發(fā)狀態(tài)四、血蛋白諒質(zhì)分們離純株化的劍一般超原則總目配標(biāo)：益增加紙制品誕純度楚或比花活1.前處榴理：確因動(dòng)/植物/細(xì)菌無而異2.粗分窗級分拐離：撕采用遺鹽析/等電以點(diǎn)沉奸淀/有機(jī)墊溶劑忽分級競分離星等方針法3.細(xì)分燒級分凍離：提采用茅凝膠加過濾寄、離湊子交斬?fù)Q層咳析、撤吸附街層析申以及同親和萄層析鴉等4.結(jié)晶五、度蛋白建質(zhì)的篇分離攪純化牽方法（一享）根據(jù)網(wǎng)分子南大小蹤蝶不同美的純疾化方悉法1、透比析和警超過悲濾利用營蛋白埋質(zhì)分撕子不帶能透攔過半笑透膜矛將其與小瞞分子夢物質(zhì)蕩分開半透兆膜為茶玻璃蔽紙或卵纖維夕素材誼料血液睛透析小分子溶出小分炸子被敢?guī)С鐾肝隼諜C(jī)透析尺液加壓血液2、密傲度梯超度（山區(qū)帶蜂）離菠心60000~80000轉(zhuǎn)/分重力60萬～80萬倍3、凝幣膠過歐濾（二）矩利用野溶解圾度差卵別的兇純化蓋方法1.等電鬧點(diǎn)沉累淀調(diào)整贊溶液pH不同時(shí)蛋白款在各租自pI處依穩(wěn)次沉牌淀2.鹽溶贏和鹽魄析3.有機(jī)唇溶劑海分級淚分離柴法降低題介電蛋常數(shù)爭奪精水化即膜原理驕：蛋白轎質(zhì)在辱非等繁電點(diǎn)朋時(shí)所逆帶總左電荷段不為0分子滑大小凳不同點(diǎn)，電讓場中林移動(dòng)案速度御也不屯同（三躍）根立據(jù)電驅(qū)荷不慕同的鋸純化腦方法對角線電泳等電吧聚焦舞電泳雙向般電泳雙向漆電泳離子色交換棋層析離子刮交換各色譜（四）萬利用跡蛋白殺質(zhì)選脅擇性館吸附星的性浙質(zhì)羥磷忍石灰體層析疏水黎作用辨層析（五）蠻利用逼對配貨體的蓬特異壓生物鑒學(xué)朵親和征力的偏純化刺方法親和鳳色譜設(shè)顆粒具有棚極強(qiáng)穿的專左一性親和除色譜六、吹蛋白蛇質(zhì)含飄量測否定和歐純度斃鑒定測定庭蛋白琴質(zhì)總湊量的渡常用壯方法:凱氏抖定氮鄭法雙縮真脲法Fo堡li礦n-酚試竄劑法(L序ow閉ry法)紫外仔吸收應(yīng)法染料陪結(jié)合廟法(B趕ra也df銀or鬧d)BC倡A法膠體賴金測蛇定法（一界）蛋軍白質(zhì)