影響免疫組化染色的因素及對(duì)策

關(guān)于影響免疫組化染色的因素及對(duì)策第1頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結(jié)果的基礎(chǔ)和前提。由于免疫組化染色過(guò)程中存在很多步驟或環(huán)節(jié)，每一個(gè)步驟或環(huán)節(jié)都可能影響到染色的最終結(jié)果，因此，要做好一張高質(zhì)量的免疫組化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技術(shù)員和病理醫(yī)生密切配合、相互協(xié)調(diào)、共同努力才能保證做出合格的免疫組化切片。第2頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、影響免疫組化染色質(zhì)量的因素1、標(biāo)本的固定手術(shù)標(biāo)本的及時(shí)固定是保證免疫組化染色質(zhì)量的關(guān)鍵。未能及時(shí)固定的組織，會(huì)造成細(xì)胞的變性和自溶，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的破壞和抗原物質(zhì)的彌散，在免疫組化染色上表現(xiàn)為抗原定位的變化和背景染色的增高。過(guò)度的固定會(huì)造成抗原決定簇的封閉和抗原的丟失。第3頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三同一病例的ER表達(dá)情況ERER固定不及時(shí)固定二周后取材固定8小時(shí)后取材第4頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三未及時(shí)固定的乳腺癌組織ER表達(dá)胞漿著色第5頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三影響免疫組化染色質(zhì)量的因素2、切片質(zhì)量的影響切片太厚、皺褶，刀痕，敷貼不牢固，以及脫蠟不徹底，均會(huì)影響免疫組化的染色質(zhì)量，易出現(xiàn)非特異性染色和染色不均勻。第6頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三影響免疫組化染色質(zhì)量的因素3、抗原修復(fù)環(huán)節(jié)的影響抗原修復(fù)環(huán)節(jié)在免疫組化染色中是極為重要的環(huán)節(jié)。不同的修復(fù)時(shí)間、不同的修復(fù)方法、不同的抗原修復(fù)液，最終的結(jié)果會(huì)有差異。第7頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三同一蠟塊不同修復(fù)方式的結(jié)果ERHer-2(2+)Her-2(1+)微波修復(fù)水浴修復(fù)第8頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三同一蠟塊不同修復(fù)時(shí)間的結(jié)果第9頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三同一蠟塊使用不同修復(fù)液的結(jié)果Ki-67EDTA檸檬酸第10頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三4、操作過(guò)程中細(xì)節(jié)問(wèn)題的影響滴加抗體未完全覆蓋組織，PBS殘留過(guò)多，操作過(guò)程中切片干燥等原因，會(huì)出現(xiàn)邊緣效應(yīng)和染色不均勻及北京染色等。第11頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三抗體覆蓋組織不完全造成的邊緣效應(yīng)第12頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三抗體覆蓋不均勻的灶狀著色第13頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三影響免疫組化染色質(zhì)量的因素5、第一抗體、檢測(cè)系統(tǒng)的影響使用不同克隆、不同種屬來(lái)源的抗體，不同的檢測(cè)系統(tǒng)，免疫組化的染色會(huì)產(chǎn)生差異。使用三步法試劑盒（如SP法）生物素系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化染色時(shí)，如果操作不當(dāng)會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的背景染色。第14頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三影響免疫組化染色質(zhì)量的因素6、顯色劑、復(fù)染劑的影響不同的DAB顯色試劑盒、不同的顯色時(shí)間，會(huì)對(duì)免疫組化染色強(qiáng)度及級(jí)別判斷產(chǎn)生影響。蘇木素復(fù)染過(guò)深、過(guò)淺，對(duì)比都不清晰。第15頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三DAB顯色恰當(dāng)GST-π第16頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三DAB顯色恰當(dāng)CK5/6第17頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三Ki-67第18頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三胸腔積液離心包埋細(xì)胞塊的免疫組化染色TTF-1CK7第19頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三Calponin第20頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三TOPOⅡ第21頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三CK5/6第22頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三P63第23頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三DAB顯色適當(dāng)，蘇木素復(fù)染過(guò)淺第24頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、免疫組化染色的質(zhì)量控制組織固定1、標(biāo)本在離體后應(yīng)立即浸泡于相當(dāng)于標(biāo)本體積8~10倍的標(biāo)準(zhǔn)固定液中，大標(biāo)本要剖開(kāi)固定。離體后標(biāo)本固定前存放不得超過(guò)30分鐘。2、在實(shí)際工作中，就可操作性而言，10%的緩沖福爾馬林是兼顧保存組織形態(tài)和抗原性通行的、被廣泛接受的選擇。3、適度、適時(shí)的固定。一般而言，大標(biāo)本只要做到及時(shí)切開(kāi)固定，在室溫下12小時(shí)即可達(dá)到固定要求；為了適應(yīng)免疫組化染色標(biāo)準(zhǔn)化的需要，標(biāo)本固定后應(yīng)及時(shí)取材，通常固定時(shí)間不得超過(guò)24小時(shí)。4、達(dá)到固定時(shí)間要求而不能及時(shí)進(jìn)入脫水程序的標(biāo)本，建議將標(biāo)本置入70%的乙醇中進(jìn)行暫時(shí)保存直至進(jìn)入組織脫水程序。第25頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三免疫組化染色的質(zhì)量控制脫水及制片1、建立嚴(yán)格的組織脫水試劑規(guī)范化更換制度，保證組織處理質(zhì)量。2、切片厚度一般3~4μm，厚薄均勻、平整，無(wú)刀痕、折疊，采用高質(zhì)量防脫載玻片。3、切片在60℃烤箱內(nèi)烤2~3小時(shí)，或者70℃烤箱內(nèi)1小時(shí)。4、脫蠟要和常規(guī)切片分開(kāi)，使用單獨(dú)的二甲苯，如果溫度過(guò)低或二甲苯使用次數(shù)較多，可適當(dāng)延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間。第26頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三免疫組化染色的質(zhì)量控制抗原修復(fù)抗原修復(fù)的方式有多種，熱修復(fù)一般推薦高壓鍋熱修復(fù)法，但是微波修復(fù)也有其方便的一面。影響抗原修復(fù)的基本因素是加熱的溫度和加熱的時(shí)間，以及所使用的修復(fù)液的PH值。需要操作者在實(shí)際工作中摸索總結(jié)，同時(shí)要根據(jù)每種抗體的具體要求，找到較適合的修復(fù)方式。抗原修復(fù)的恰當(dāng)與否，直接關(guān)系到免疫組織化學(xué)染色的成敗，進(jìn)一步影響最后結(jié)果的正確判讀。第27頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三免疫組化染色的質(zhì)量控制抗體及檢測(cè)系統(tǒng)的選擇選擇優(yōu)良的抗體和檢測(cè)試劑盒，新買抗體要進(jìn)行敏感性測(cè)試，找到最佳的抗原修復(fù)條件，每次試驗(yàn)要設(shè)置相應(yīng)的陽(yáng)性和陰性對(duì)照。試劑的使用一定在其有效期內(nèi)，同時(shí)經(jīng)常觀察抗體使用過(guò)程中的結(jié)果變化，如不理想要及時(shí)更換。第28頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三免疫組化染色的質(zhì)量控制顯色和復(fù)染不要忽視顯色過(guò)程，和常規(guī)染色類似，顯色不恰當(dāng)也會(huì)造成染色的前功盡棄。不同的組織、不同的抗體顯色時(shí)間有差異，必要時(shí)使用顯微鏡觀察切片的顯色效果。蘇木素復(fù)染過(guò)深過(guò)淺都會(huì)造成對(duì)比不清晰，不利于觀察評(píng)價(jià)。第29頁(yè)，講稿共32頁(yè)，2023年5月2日，星期三免疫組化染色的質(zhì)量控制影響免疫組化染色的因素很多。在操作中應(yīng)注重細(xì)節(jié)，避免隨意性，嚴(yán)格按照技術(shù)流程規(guī)范化操作，一個(gè)小的細(xì)節(jié)的疏忽或隨意性操作