反相高效液相色譜

反相高效液相色譜

reversed-phasehigh-performanceliquidchromatography

高效液相的簡介概念：高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。

發(fā)展歷史：1906年俄國植物化學家茨維特（Tswett）首次提出“色譜法”（Chromotography）和“色譜圖”（Chromatogram）的概念。1930年以后，相繼出現了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術。1952年，英國學者Martin和Synge提出了關于氣－液分配色譜的比較完整的理論和方法。1958年，基于Moore和Stein的工作，離子交換色譜的儀器化導致了氨基酸分析儀的出現，這是近代液相色譜的一個重要嘗試，但分離效率尚不理想。1960年中后期，氣相色譜理論和實踐發(fā)展，以及機械、光學、電子等技術上的進步，液相色譜又開始活躍。到60年代末期把高壓泵和化學鍵合固定相用于液相色譜就出現了HPLC。1970年中期以后，微處理機技術用于液相色譜，進一步提高了儀器的自動化水平和分析精度。1990年以后，生物工程和生命科學在國際和國內的迅速發(fā)展，為高效液相色譜技術提出了更多、更新的分離、純化、制備的課題，如人類基因組計劃，蛋白質組學有HPLC作預分離等。HPLC特點：高效液相色譜法有“四高一廣”的特點：①高壓：流動相為液體，流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓

②高速：分析速度快、載液流速快，較經典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內即可完成，一般小于1小時

③高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍

④高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數量級⑤應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢

HPLC分類：按照分離機理的不同，可分為以下幾類

HPLC1、吸附色譜法(adsorptionchromatography）：以吸附劑為固定相的色譜2、液-液分配色譜法(liquid-liquidchromatography)：液-液分配色譜的固定相和流動相是互不相溶的兩種溶劑，分離時，組分溶入兩相，不同的組分因分配系數(K)的不同而被分離3、離子交換色譜法(ionexchangechromatography)：以離子交換劑為固定相的色譜方法，組分因和離子交換劑親4、空間排斥色譜法(stericexclusionchromatography)：空間排斥色譜也稱為凝膠色譜。其固定相是具有一定孔徑范圍的多孔性物質，即凝膠。被分離組分因分子空間尺寸大小的不同而被分離

5、親和色譜法(lighperformanceaffinitychromatography)：是利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從生物樣品中分離和分析一些特殊物質的色譜方法6、手性色譜法(chiralchromatography)：對映體在普通條件下的理化性質是相同的，因此分離對映體需要在手性條件下進行。分離對映體的色譜方法稱為手性色譜法。手性色譜法分為間接法和直接法兩種。間接法是將對映體與一定的手性衍生化試劑反應，使其由對映體轉變?yōu)榉菍τ丑w，再利用他們理化性質的差異，用一般的色譜條件進行分離。直接法不需作衍生化反應，直接利用手性色譜柱或手性流動相進行分離，應用較多液液分配色譜法中的化學鍵合固定相：目前廣泛使用的化學鍵合固定相是將固定液的官能團鍵合在載體上而制成的，使用化學鍵合固定相的色譜方法(簡稱鍵合相色譜法)可以用分配色譜的原理加以解釋。鍵合相色譜法在HPLC中占有極其重要的地位，是應用最廣的色譜法。按照固定相和流動相極性的不同，分配色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法兩類。分配色譜法正相色譜法(normalphasechromatography)固定相極性大于流動相極性的分配色譜法稱為正相分配色譜法，簡稱為正相色譜法。氰基鍵合硅膠、氨基鍵合硅膠等極性的化學鍵合固定相是正相色譜常用的固定相，正相色譜的流動相一般為極性較小的有機溶劑。在正相色譜中，極性小的組分由于K值較小先流出，極性較大的組分后流出。正相色譜法用于溶于有機溶劑的極性及中等極性的分子型物質的分離。反相色譜法(reversedphasechromatography)流動相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相分配色譜法，簡稱為反相色譜法。反相色譜法使用非極性固定相，最常用的非極性固定相是十八烷基硅烷鍵合硅膠，還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等。流動相常用水與甲醇、乙腈或四氫呋喃的混合溶劑。在反相色譜中極大的組分因K值較小先流出色譜柱，極性較小的組分后流出。流動相中有機溶劑的比例增加，流動相極性減小，洗脫力增強。反相色譜法是目前應用最廣的高效液相色譜法。高效液相色譜的結構及原理鈣調蛋白肽段的反相HPLC分離實驗實驗儀器和試劑：儀器：反相高效液相色譜儀離心機試劑：乙腈水0.1%TFA溶劑鈣調蛋白消化酶實驗步驟：1、打開HPLC，設定所需數值，如：波長（210nm），流動相流量和比例（乙腈5%到70%v/v梯度）2、樣品處理：樣品消化，真空離心濃縮3、待基線平衡和壓力穩(wěn)定后，注射進樣4、收集與監(jiān)測器上出現的吸收峰相對應的組分實驗就結果速：實驗端注意毫事項踢：1、蛋喜白質撿是具昨有邊車緣疏具水性后的偶檢極離誕子，放因此頑色譜流柱必秤須是絡帶有艦芳族刺或者崖脂族申的硅煉膠2、RP跪-H導PL慢C要用福有機值溶劑搶來分辨離分榮子，朱此類內溶劑世會破清壞蛋蕩白質劑的三俘維結灰構，淹因此娛此種摟方法訪只適即合用裕來分慰離制友備化柿學分耀析用潔