流式細(xì)胞術(shù)的操作、原理與應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)

---原理、操作及應(yīng)用主要內(nèi)容一、流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)和原理流式細(xì)胞術(shù)簡介流式細(xì)胞儀的光信號檢測流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成熒光抗體的選擇流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析二、流式細(xì)胞術(shù)操作與技巧三、流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1.1流式細(xì)胞術(shù)簡介流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細(xì)胞(或生物學(xué)顆粒)的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。流式細(xì)胞儀（FlowCytometer）是集細(xì)胞與分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、計算機技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。流式細(xì)胞術(shù)的特點檢測對象：單細(xì)胞懸液或生物顆粒；檢測參數(shù)：多參數(shù)；檢測特點：單細(xì)胞水平分析；檢測速度：高速，最高達(dá)上萬個細(xì)胞/秒；檢測結(jié)果：精度高、準(zhǔn)確性好；可對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分選；流式細(xì)胞儀的分類分析型流式細(xì)胞儀細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。分選型流式細(xì)胞儀既能流式分析，還能對分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選；進(jìn)樣管道較長，還需要保持無菌狀態(tài)，所以分選型流式細(xì)胞儀一般只用于分選。流式細(xì)胞儀的發(fā)展及商品化1934Moldavanl:Firsttry(固定式細(xì)胞分析-流動式)；1953Crosland-Taylor:鞘流系統(tǒng)(解決難題)；1956Coulter原理(血細(xì)胞計數(shù)器)；1965Kamentsky:分光光度計定量細(xì)胞成分和散射光應(yīng)用；1967Kamentsky等設(shè)計了細(xì)胞分選的裝置；1969Vandilla等:第一臺熒光檢測細(xì)胞計(鞘流聚焦、激光)；1972斯坦福大學(xué):研制出熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)；1973BD公司與斯坦福大學(xué)合作，研制生產(chǎn)第一臺商用流

式細(xì)胞儀-FACSⅠ。1975Kohler和Milstein:單克隆抗體技術(shù)(促進(jìn)流式發(fā)展)。BD公司分析型流式細(xì)胞儀FACSCalibur雙激光四色，市場覆蓋率最高LSRII雙激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配FACSCantoII雙激光六色，三激光八色FACSVerse雙激光六色，三激光八色BD公司分選型流式細(xì)胞儀FACSVantageSEFACSAriaIIIInflux1.2流式細(xì)胞術(shù)光信號檢測光信號的類型散射光信號：與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)，是細(xì)胞的固有參數(shù)。前向散射光(forwardscatter,FSC);側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).熒光信號自發(fā)熒光(細(xì)胞色素因子、核黃素)：微弱特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出

的熒光，比自發(fā)熒光強很多倍。1.2.1散射光信號（一）前向散射光FSC

FSC信號方向與激光束平行，偏離度一般在1-6度范圍內(nèi)，亦稱小角度散射光，主要反映被測細(xì)胞的體積大小和活力。（二）側(cè)向散射光SSCSSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱90度散射光，其信號強度反映細(xì)胞內(nèi)部顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化。（三）散射光的作用實驗中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片死細(xì)胞或碎片粘連細(xì)胞腫瘤細(xì)胞株FSC/SSC散點圖死細(xì)胞加藥處理后FSC/SSC散點圖通過FSC/SSC散點圖，gate出目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分析。1.2.2熒光信號（一）熒光：

物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。發(fā)射波長(熒光波長)Emissionwavelength激發(fā)波長Excitationwavelength＜（二）常用熒光素<499nm藍(lán)色熒光（Blue）；

500-549nm，綠色熒光（Green）；550-584nm，黃色熒光（Yellow）；

585-615nm，橙色熒光（Orange）；616-700nm，紅色熒光（Red）；

≥700nm，遠(yuǎn)紅外熒光（Far-Red）。標(biāo)記抗體的熒光素?zé)晒馑胤肿蛹ぐl(fā)光波長（nm）發(fā)射光波長（nm）中文名FITC490520異硫氰酸熒光素PE488575藻紅蛋白PerCP490675多甲藻葉綠素蛋白APC650660別藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻紅蛋白-花青素5PE-Cy7496/546767藻紅蛋白-花青素7Alexa

Flour488495519AlexaFlour647650665核酸熒光染料PI（碘化丙啶535,623）可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對中。常用于DNA分析，需要用RNase處理細(xì)胞排除RNA對DNA熒光定量的影響；PI不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞。7-AAD（7-氨基放線菌素D545,647）以插入的方式與DNA鏈的G-C堿基對結(jié)合，不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式與DNA鏈上的A-T堿基對特異性結(jié)合。變異系數(shù)明顯小于其他染料，一種理想的DNA定量染料。Hoechst（343,450）常見為Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式與DNA鏈上的A-T堿基對結(jié)合。能對活細(xì)胞染色，用于活細(xì)胞DNA定量分析，如精子分選；還用于側(cè)群細(xì)胞的分選。PY（派若寧560,573）RNA染料，能進(jìn)入活細(xì)胞。AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黃綠色熒光，RNA呈橙黃色熒光，可進(jìn)行DNA/RNA雙參數(shù)分析。1.3流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)流動室液流驅(qū)動系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)激發(fā)光源光束收集系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)噴嘴電偏轉(zhuǎn)板樣本收集器1.3.1液流系統(tǒng)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來的技術(shù)，可以實現(xiàn)兩種液體的同軸流動，樣本細(xì)胞流位于軸心穩(wěn)定流動，外面包裹有鞘液(sheath)。流體動力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一個聚焦收縮作用，細(xì)胞流直徑被約束在10-20um，避免了多個細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測區(qū)。鞘液鞘液細(xì)胞流激光照射點流體動力學(xué)聚焦示意圖1.3.2光學(xué)系統(tǒng)（一）激發(fā)光源：激光器氣體激光器：氬離子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪離子(647nm)、氪氬(568nm)；染料激光器：如氬離子激光泵浦的Rhodomin6G水溶液染料激光器，發(fā)出550-650nm可變波長激發(fā)光；半導(dǎo)體激光器：價格低、結(jié)構(gòu)簡單、壽命長。BD的FACSCalibur已采用635nm半導(dǎo)體激光器。激光特點：單波長、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照?，F(xiàn)在儀器常配有儀器選配2-4根激光器，波長多為488nm、633nm和355nm、405nmUV；（二）光收集系統(tǒng)濾光片的組成長通濾片(LP)：只允許特定波長以上的光束通過；短通濾片(SP)：只允許特定波長以下的光束通過；帶通濾片(BP)：只允許一定波長范圍內(nèi)的光束通過。Long

passShortpassBandpass460500540SP500LP500BP500/50460500540460500540全反射光路FACSAria流式細(xì)胞儀器信號檢測系統(tǒng)PE-Cy7PerCP-Cy5.5PE-TexasRedPEFITCSSC1.3.3電子系統(tǒng)光電檢測器將光信號轉(zhuǎn)換成電子信號。前置放大電路將信號等比例放大，輸出電脈沖信號。模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬的電脈沖信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算機系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。（一）光電檢測器(photodetector)光電二極管(photodiode)光靈敏度低，測定強信號（FSC）；光電倍增管(photomultiplier,PMT)光靈敏度高，測定弱信號（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光光電二極管（二）電信號兩種放大方式由于光信號比較弱，需將其等比例放大，方便計算機分析處理，一般信號的放大可以使用線性或?qū)?shù)兩種方式。

線性(linear;lin)對數(shù)(logarithmic;log)一般FSC和SSC變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號變異范圍較大，多使用對數(shù)放大。（三）熒光信號的面積A、寬度W和高度H細(xì)胞通過激光檢測區(qū)域時，產(chǎn)生的熒光信號被光電倍增管接收，形成脈沖信號。熒光信號脈沖形成示意圖TimeVoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0熒光信號脈沖的面積、高度和寬度Width=Area/Height一個信號脈沖有高度、面積和寬度。光信號電信號數(shù)字信號通道(channel)

一個光電檢測器就是一個通道，有多少個光電二極管/倍增管，就有多少個通道：散射光通道:FSC通道和SSC通道；熒光通道通道命名方式：以FL(fluorescence)加數(shù)字命名，如FL1、FL2、FL3等。以該通道接收的主要熒光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。Forexample：FACSCalibur有488nm和633nm兩根激光器，488nm能檢測FSC、SSC、FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(PerCP)，635能檢測FL4(APC)，代表Calibur有6個通道，最多能同時檢測4個熒光，6種參數(shù)。1.3.4流式分選

電荷式分選超聲振動器(15-100kHz)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)板收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)lasers斷裂點(充電)高壓偏轉(zhuǎn)板四路分選原理電荷式分選裝置分選指標(biāo)分選時間由三方面決定：進(jìn)樣速度、目標(biāo)細(xì)胞所占比例、需要收集的細(xì)胞數(shù)。需要細(xì)胞數(shù)目標(biāo)細(xì)胞所占比例(%)15501041.7min20s2s10516.8min3.4min20s1062.8h3.4min3.4min1071.2天5.6h34min分選時間表(機器流速10000個/s時)分選速度、分選純度和分選收獲率，相互影響。分選純度指被分選出來的細(xì)胞所占的百分比，一般能達(dá)99%以上。分選收獲率是指被分選出的細(xì)胞與原來總細(xì)胞的百分比。分選純度和收獲率永遠(yuǎn)是相互矛盾的，純度提高，收獲率降低，反之亦然。富集模式(enrichmode)純化模式(purifymode)單細(xì)胞模式(singlecellmode)1.4熒光抗體的選擇A根據(jù)流式細(xì)胞儀選擇抗體流式細(xì)胞儀能檢測的通道數(shù)(由激光器種類、數(shù)量和使用的光學(xué)濾片決定)。如FACSCalibur：多色標(biāo)記熒光素搭配原則：每個通道只能選擇一種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。488FL1BP530/30515-545FITC、AF488FL2BP585/42564-606PEFL3670LP﹥670PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7635FL4BP661/16653-669APC、AF647B根據(jù)抗原表達(dá)強弱合理選擇抗體不同的熒光素強度有所不同；高表達(dá)的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的熒光素分配給表達(dá)低的抗原：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC選擇熒光波譜間光譜重疊較小的熒光染料進(jìn)行組合，同時需要正確的調(diào)節(jié)補償。CD51.5FCM數(shù)據(jù)存儲、顯示與分析標(biāo)準(zhǔn)的FCM數(shù)據(jù)采用列表模式（listmode），記錄了每個細(xì)胞的所有參數(shù)的信息。每個細(xì)胞檢測5個參數(shù)，那么獲取10000個細(xì)胞，容量為5×10000（字或雙字）。Event#FSCSSCFL1FITCFL2PEFL3APC110050010650421105057007006390480720670104954901572015……FCM數(shù)據(jù)顯示方式單參數(shù)直方圖(Histogram)雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示：散點圖(DotPlot)偽彩圖(Pseudo-colorPlot)等高線圖(ContourPlot)密度圖(DensityPlot)假三維圖(Pseudo3DPlot)三維圖(3DPlot)常用分析軟件CellQuestDivaFlowJOWinMDIFCSExpress直方圖Histogram細(xì)胞的某一單參數(shù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分布圖，橫坐標(biāo)表示熒光信號或散射光信號相對強度的值，單位是道數(shù)，縱坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)。Event#FL1FITC11027003720415……0…………10…………100…………1000CountsFITC熒光強度橫坐標(biāo)既可以是線性的，也可以是對數(shù)的。DNA倍體分析抗原表達(dá)分析Overlay圖散點圖散點圖中每個點代表一個細(xì)胞，X軸與Y軸分別代表一種參數(shù)，優(yōu)點是比直方圖直觀。FL1FL2散點圖和偽彩圖等高圖和密度圖等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞數(shù)目相等，越在里面的曲線代表細(xì)胞數(shù)目越多。密度圖：點密度越大的地方細(xì)胞越多，點密度越小的地方細(xì)胞少。假三維圖和三維圖SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC→CD45→CD14→設(shè)門與數(shù)據(jù)分析門(Gate，簡寫G)是流式細(xì)胞術(shù)中的一個重要術(shù)語，F(xiàn)CM數(shù)據(jù)分析過程實際上就是選門和設(shè)門的過程。橢圓形圓形矩形任意形狀R(Region，區(qū)域)。門可以是單一區(qū)域(G=R1)，也可以是幾個區(qū)域組合在一起：G=R1andR2;G=R1orR2;G=R1notR2。十字門線性門二、流式細(xì)胞術(shù)操作與技巧流式細(xì)胞術(shù)操作流程：培養(yǎng)細(xì)胞血液骨髓新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞懸液制備熒光染色上機檢測表型測定細(xì)胞分選繼續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計學(xué)分析2.1單細(xì)胞懸液制備2.2免疫熒光標(biāo)記2.3對照的設(shè)置2.4光譜重疊與補償2.1單細(xì)胞懸液制備2.1.1新鮮實體組織的樣本制備

對于不同組織來源的實體組織和實體瘤標(biāo)本，應(yīng)該根據(jù)各自特點選擇不同的分散細(xì)胞方法，以期達(dá)到單細(xì)胞產(chǎn)量高、損傷小的目的。常用方法有：酶消化法機械法化學(xué)試劑處理法酶消化法：根據(jù)分散組織類型來確定使用的酶類：胰蛋白酶—水解酯鍵、肽鍵；膠原酶—降解幾種分子類型的膠原；溶菌酶—水解糖蛋白、肽的糖苷鍵；彈性蛋白酶—消化糖蛋白、彈性蛋白的纖維。將新鮮組織置于離心管中，加入1-2ml酶消化20-30min（恒溫37℃或室溫），間斷振蕩或吹打；終止消化，收集細(xì)胞懸液，300目尼龍網(wǎng)過濾，除去細(xì)胞團(tuán)塊，低速離心除去細(xì)胞碎片；將制備好的單細(xì)胞懸液進(jìn)行熒光標(biāo)記或保存?zhèn)溆谩Ｗ⒁猓好傅氖褂脻舛?、溫度、消化時間、酶活性的pH值。機械法特點：易造成細(xì)胞碎片和團(tuán)塊，實際操作時，應(yīng)注意碎片和團(tuán)塊的去除，常與其他方法（如酶消化法）配合使用。組織解離器機械法：有剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法等。利用機械方法、物理方法給予組織交大的壓力，使細(xì)胞從組織間分散開來?；瘜W(xué)處理法：作用原理：將組織細(xì)胞間起黏著作用的鈣、鎂離子置換出來，從而使細(xì)胞分散開來，常用試劑有EDTA、EGTA、TPB等。EDTA是一種螯合劑，可以和組織間的鈣、鎂離子形成螯合物，實際運用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白酶）。特點：用化學(xué)法細(xì)胞存活率低、細(xì)胞產(chǎn)額低，細(xì)胞碎片和聚集量不穩(wěn)定。機械法往往造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細(xì)胞產(chǎn)量，注意去除細(xì)胞碎片和團(tuán)塊以免影響FCM結(jié)果，如低速離心去碎片、尼龍網(wǎng)過濾團(tuán)塊等。酶消化法、化學(xué)試劑處理法對實體組織的分散效果較理想，但會造成所測化學(xué)成分的不良影響。根據(jù)實驗?zāi)康娜ミx擇合適的單細(xì)胞懸液制備方法，最終要求細(xì)胞呈單個分散狀態(tài)；細(xì)胞碎片、團(tuán)塊盡量少；細(xì)胞活性不受到明顯損傷，保證下一步熒光染色。2.1.2石蠟包埋組織樣本制備切片：將石蠟組織切成50um厚的組織片4-5片，放入1試管中；脫脂：加入二甲苯3-5ml脫脂，室溫下1-2天，脫凈后棄二甲苯；水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步10min，去乙醇后加入蒸餾水3-5ml，3-5min后棄水；消化：加入5ml0.5%胃蛋白酶（pH1.5-2.0），37℃恒溫水浴30min，每隔5-10min振蕩一次；終止消化：加冷的PBS或生理鹽水終止消化；過濾：用300目尼龍網(wǎng)過濾，未消化好的組織可做第二次消化；收集細(xì)胞懸液：將過濾液離心沉淀，再用PBS漂洗1-2次，低速離心沉淀去除碎片；根據(jù)實驗?zāi)康臉?biāo)記熒光抗體，或保存細(xì)胞備用。2.1.3血液、骨髓樣本制備外周血單個核細(xì)胞PBMC的分離血液層Ficoll層血漿層PBMCFicoll層紅細(xì)胞層離心前離心后Ficoll密度梯度離心法分離PBMC注意：由于多核粒細(xì)胞比較大，粒細(xì)胞沉降在紅細(xì)胞層，所以該法不適合粒細(xì)胞研究；該法操作過程中可能丟失一些有意義的細(xì)胞或細(xì)胞亞群，所以臨床上一般不主張分離血液或骨髓的單個核細(xì)胞。紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞原理：紅細(xì)胞裂解液成分為低滲的NH4Cl溶液，利用雙凹型的紅細(xì)胞膜抗性差，白細(xì)胞膜抗性比較好的特點，加入低滲透壓的紅細(xì)胞裂解液時，紅細(xì)胞膜脹破，而白細(xì)胞膜不受影響，從而達(dá)到去除紅細(xì)胞的目的。2.1.4培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液制備2.1.5體液脫落細(xì)胞樣本制備懸浮生長細(xì)胞吸管反復(fù)吹打貼壁生長細(xì)胞消化處理離心獲得單細(xì)胞懸液洗脫液尿液胸腹水離心收集細(xì)胞，用生理鹽水或PBS洗滌3次300目尼龍膜過濾后離心沉淀去上清單細(xì)胞懸液2.2免疫熒光染色FCM可檢測下列細(xì)胞成分：表面標(biāo)記物胞漿標(biāo)記物核內(nèi)標(biāo)記物可溶性成分黏附因子表面受體細(xì)胞因子分泌到胞外的細(xì)胞因子胞內(nèi)抗原核酸含量核內(nèi)抗原熒光素偶聯(lián)抗體抗體上偶聯(lián)熒光素(FITC、PE等)，通過抗原抗體反應(yīng)讓目標(biāo)細(xì)胞特異性的帶上熒光。染色過程即抗原抗體反應(yīng)過程。熒光染料/熒光化合物PI、DAPI等插入核酸鏈中；CFSE和蛋白質(zhì)共價結(jié)合；AnnexinV-FITC檢測凋亡。熒光蛋白如GFP，不需要染色，直接檢測。免疫熒光染色主要包括直接和間接免疫熒光染色兩種方法。間接標(biāo)記的方法難以進(jìn)行多色標(biāo)記，而且操作復(fù)雜、信噪比高，所以一般首先直標(biāo)熒光抗體。熒光抗體熒光二抗第一抗體直接標(biāo)記間接標(biāo)記細(xì)胞表面抗原標(biāo)記一般檢測時，獲取1～2萬個細(xì)胞，標(biāo)記0.5～1×106細(xì)胞即可。下述情況細(xì)胞量需相應(yīng)增加：檢測胞內(nèi)/核內(nèi)抗原，離心次數(shù)多；細(xì)胞周期乙醇固定損失細(xì)胞多；檢測細(xì)胞在標(biāo)本中比例低···0.5～1×106個細(xì)胞孵育體積50-100ul上機體積200-500ul終濃度約1×106個/ml加染料洗滌后補加液體表面抗原分析是流式應(yīng)用中最廣泛的，標(biāo)記步驟也相對簡單。標(biāo)記：取0.5～1×106細(xì)胞，加入適量抗體(根據(jù)抗體說明書)，充分混勻后(總體積50-100ul)，4℃避光孵育10-30min。洗滌：加入1mlPBS洗液，300g離心洗滌5min。上機檢測：棄去上清后加入200-500ulPBS，重懸細(xì)胞后立即上機檢測；如不能及時上機檢測，則加入同樣體積的1%多聚甲醛，混勻后置于4℃冰箱內(nèi)保存，一般不超過24h。胞內(nèi)抗原熒光標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)抗原：如MPO；核內(nèi)抗原：如FoxP3；細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子(胞內(nèi)因子)：IFN-r、IL-4、IL-17等。固定：4％多聚甲醛破膜/透化0.05%皂素(saponin)；0.01%TritonX-100

70%乙醇膜表面抗原染色：分別加入相應(yīng)的熒光素標(biāo)記抗體和適量細(xì)胞標(biāo)本，充分混勻后避光孵育10-30min。洗滌：加1mlPBS洗液，300g離心5min。固定：去上清后加入500ul4%多聚甲醛，固定20min。透化：離心洗去固定劑后，加皂素500ul，透化10min。胞內(nèi)抗原染色：離心洗去透化液后，加入相應(yīng)熒光素標(biāo)記抗體，混勻后室溫避光孵育30min。洗滌：加1mlPBS洗液，300g離心5min。上機檢測：棄去上清后加入PBS200-500ul后上機檢測。2.3對照的設(shè)置空白對照細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)自身也發(fā)出熒光，能被FCM靈敏的檢測到，這種未染色的細(xì)胞自身發(fā)出的一些熒光稱為自發(fā)熒光。設(shè)置空白對照（未染色的細(xì)胞），用以區(qū)分細(xì)胞的自發(fā)熒光和特異性熒光，避免假陽性的結(jié)果。流式結(jié)果中熒光強弱是一個相對值，光電倍增管電壓越大，電子信號越強；電壓越小，信號越弱。通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性對照管的熒光強度處于陰性的位置，實驗組的熒光值都是相對對照組。001001002陽性對照PositiveControl設(shè)置陽性對照是為了檢測熒光抗體是否有效，并不是每次分析時都必須設(shè)置：使用新的熒光素抗體時；使用存儲時間較長的熒光素抗體時。設(shè)置陽性對照的方法：用肯定表達(dá)有該抗原的細(xì)胞來檢測；已經(jīng)證明有效的、偶聯(lián)其他熒光素的該抗原的抗體。單標(biāo)對照SingleStainingControl兩色或多色實驗時須設(shè)置單標(biāo)對照，用于補償?shù)恼{(diào)節(jié)；單標(biāo)實驗時不需要。2.4光譜重疊與補償當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種以上熒光素激發(fā)出不同波長熒光時，理論上可選擇濾光片使每種熒光僅被相應(yīng)的通道檢測到。但由于目前使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間各自發(fā)射的峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊，因而少量的熒光信號會被另一通道檢測到，這種現(xiàn)象就是光譜重疊(spectraloverlap)。FL1530/30FL2585/42發(fā)射波長FITC發(fā)射譜PE發(fā)射譜實驗操作中，常利用電子技術(shù)和計算機軟件設(shè)置的方法將串入相鄰熒光通道的信號扣除，這種技術(shù)稱為熒光補償(fluorescencecompensation)。FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1-%FL2補償前補償后FITC單標(biāo)PE單標(biāo)未補償正確補償FITC-PE補償太大PE-FITC補償太大補償調(diào)節(jié)要合適三、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異性抗原（細(xì)胞表面/胞漿/核）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞活性酶活性激素結(jié)合位點細(xì)胞受體細(xì)胞功能在上述分析基礎(chǔ)上進(jìn)行分選生物學(xué)功能的應(yīng)用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)-磷酸化細(xì)胞因子定量檢測—CBA微球技術(shù)遺傳毒理-微核實驗吞噬功能MicroRNA作用后蛋白表達(dá)研究多重?zé)晒獾鞍讬z測細(xì)胞群比例測定細(xì)胞表型細(xì)胞周期細(xì)胞凋亡細(xì)胞增殖細(xì)胞活性GFP轉(zhuǎn)染絕對計數(shù)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測鈣離子流動性檢測經(jīng)典應(yīng)用新應(yīng)用應(yīng)用領(lǐng)域植物DNA含量測定植物熒光蛋白檢測工業(yè)微生物精子活性檢測細(xì)菌研究海洋微生物制藥基因與蛋白工程基礎(chǔ)免疫學(xué)研究免疫標(biāo)志的檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞巨噬細(xì)胞免疫功能的檢測感染免疫干細(xì)胞研究腫瘤學(xué)細(xì)胞治療研究自身免疫性疾病糖尿病肥胖傳統(tǒng)領(lǐng)域新領(lǐng)域3.1檢測細(xì)胞周期3.2檢測細(xì)胞凋亡3.3檢測細(xì)胞增殖3.4免疫細(xì)胞亞型檢測3.5檢測細(xì)胞因子3.6檢測細(xì)胞吞噬功能3.7流式分選定義：是指能持續(xù)分裂的真核細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束后，再到下一次分裂結(jié)束的這種周而復(fù)始的循環(huán)過程。細(xì)胞周期包括有絲分裂期（M期）和分裂間期（G1，S和G2期）DNA合成前期相對靜止期DNA合成期DNA合成后期細(xì)胞分裂期2倍體4倍體2倍體-4倍體3.1檢測細(xì)胞周期DNA含量在細(xì)胞周期的體現(xiàn)細(xì)胞周期DNA倍體G0期：DNA合成靜止2CG1期：DNA合成前期2CS期：DNA合成期2C-4CG2期：DNA合成結(jié)束4CM期：有絲分裂4C正常細(xì)胞DNA含量穩(wěn)定在2C水平性細(xì)胞DNA含量為1C凋亡細(xì)胞DNA斷裂，DNA含量<2C增殖期的細(xì)胞DNA含量由2C增加至4C流式檢測細(xì)胞周期原理處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含量不同，G0/G1期細(xì)胞含有二倍體量的DNA，G2/M期細(xì)胞含有四倍體量的DNA，而S期細(xì)胞DNA含量處于二倍體和四倍體量之間。DNAContentDNA熒光染料能與DNA結(jié)合，DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的多少。通過流式檢測就能反映細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，區(qū)分細(xì)胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例。細(xì)胞周期分析核酸染料細(xì)胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶)、EB(溴化乙啶)，不能進(jìn)入完整細(xì)胞膜，標(biāo)記時需要通過固定等方法增加細(xì)胞膜的通透性。細(xì)胞膜通透性染料：DAPI、Hoechst，能染活細(xì)胞的DNA，但需紫外激光激發(fā)。PI標(biāo)記法檢測細(xì)胞周期需要乙醇固定增加細(xì)胞膜的通透性；需要加RNase，去除RNA對DNA的干擾。PI法檢測細(xì)胞周期一般步驟：收集單細(xì)胞懸液(1×106個)，緩慢加入1ml預(yù)冷的70％乙醇，于4℃固定過夜，或-20℃長期固定。離心收集細(xì)胞，再以1mlPBS徹底洗去乙醇；去上清后加入染色液(包含50ug/mlPI，100ug/mlRNaseA，0.2%TritonX-100)，37℃染色30min后上機檢測。

細(xì)胞周期檢測結(jié)果通過流式檢測，能得出G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例。增殖指數(shù)(proliferousindex,PI)：指處于S期和G2/M期細(xì)胞之和占總細(xì)胞的比例，反映了細(xì)胞的增殖能力。CV值(變異系數(shù))：衡量儀器測量分辨率和精度的指標(biāo)。脾臟細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞雙聯(lián)體細(xì)胞的去除

利用信號脈沖FL2-W/FL2-A區(qū)別標(biāo)本中的粘連細(xì)胞以及碎片，最大程度的減少假陽性。G1雙聯(lián)體細(xì)胞G2/M細(xì)胞FL2-WFL2-WFL2-HFL2-HFL2-WFL2-API標(biāo)記法第一幅圖：FSC和SSC散點圖，在FSC-A/SSC-A散點圖中圈中目標(biāo)細(xì)胞群；第二幅圖：在PI-W/PI-A散點圖中設(shè)定單個細(xì)胞門（R1），去除粘連細(xì)胞；第三幅圖：在PI-A直方圖中顯示R1中細(xì)胞的DNA含量直方圖1G1雙聯(lián)體細(xì)胞G2/M細(xì)胞FL2-WFL2-WFL2-HFL2-HFL2-WFL2-A細(xì)胞周期檢測臨床意義發(fā)現(xiàn)DNA異倍體(二倍體峰DI>1.1或<0.9；四倍體峰DI>2.1或<1.9)，診斷為腫瘤或癌前病變；如無明顯異倍體，但有一個突出的4倍體細(xì)胞峰和>15%的S期細(xì)胞，并伴有G0/G1峰的CV>9%，提示為腫瘤或增生旺盛的病變DNA倍體分析病變腫瘤細(xì)胞常出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和染色體異常，流式檢測DNA含量能反映異倍體情況。二倍體異倍體異倍體DNA分析常用術(shù)語1.變異系數(shù)（CoefficientofVariation，CV）細(xì)胞群體之間DNA含量的細(xì)微差別可能具有顯著的生物學(xué)意義。表示流式分析中DNA含量的分辨率或精確度。通常由G0/G1峰的CV來反映【%CV=（SD/mean）x100】一般CV越小，峰形越好，越尖銳。能控制在5%左右精度足夠，一般小于8%-10%認(rèn)為可信。2.DNA指數(shù)（DNAindex，DI）DNA指數(shù)，指的是腫瘤樣本G0/G1峰的平均熒光強度與正常二倍體G0/G1峰的平均熒光強度（Mean）之間的比值。DI為1意味著二倍體（2c）（一般正常范圍為0.9-1.1）。高于或低于1表示細(xì)胞/組織中DNA含量異常,常稱為DNA非整倍體。3.倍體（Ploidy）原指染色體數(shù)目，流式中為描述總的DNA含量。二倍體細(xì)胞有正常細(xì)胞的DNA含量但不除外染色體異常。二倍體：DI為0.85-1.15四倍體：DI為1.9-2.1多倍體：DI>2.1，其余DI值均為非整倍體異倍體精子單倍體細(xì)胞3.2檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡方式主要有兩種：包括細(xì)胞壞死(necrosis)和細(xì)胞凋亡(apoptosis)。細(xì)胞凋亡，也稱細(xì)胞程序性死亡，是細(xì)胞受基因調(diào)控的一種主動性的、高度有序的結(jié)束自己生命的過程。凋亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和生化上有明顯的特征，如細(xì)胞皺縮、核固縮、細(xì)胞膜卷曲、DNA片段化、線粒體電位發(fā)生變化。根據(jù)這些特征，流式有多種方法能定性及定量的檢測細(xì)胞凋亡情況。檢測細(xì)胞凋亡的方法胞質(zhì)密度增加膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻形態(tài)學(xué)變化線粒體膜電位消失生物化學(xué)變化正常胸腺細(xì)胞凋亡胸腺細(xì)胞傳統(tǒng)檢測凋亡的方法：顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察；細(xì)胞DNA提取物的電泳實驗；細(xì)胞內(nèi)凋亡信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)研究（如ELISA,IHC,Westernblot）；細(xì)胞凋亡流式檢測方法細(xì)胞凋亡流式檢測指標(biāo)細(xì)胞膜變化的檢測AnnexinV/PI雙染法SYTO/PI雙染法線粒體損傷檢測線粒體膜電位檢測細(xì)胞色素C檢測相關(guān)凋亡酶的檢測Caspase-3的檢測細(xì)胞核DNA的檢測凋亡峰檢測TUNEL檢測（末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)）3.2.1亞二倍體(Sub-G1)峰的檢測

凋亡細(xì)胞核小體崩解，DNA含量減少，加之由于DNA的降解，與熒光染料的結(jié)合減少，因此DNA染料的著色能力下降，熒光強度降低，表現(xiàn)在G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，即亞G1峰(凋亡峰)。細(xì)胞凋亡峰Sub-G1四倍體峰二倍體峰PINumber3.2.2AnnexinV/PI雙染法正常細(xì)胞膜是不對稱性的，胞漿面含有帶負(fù)電的磷脂(如磷脂酰絲氨酸,PS)。早期凋亡時，細(xì)胞表面不對稱性發(fā)生改變，PS外翻到胞外側(cè)。AnnexinV是一種Ca2+依賴性的對PS有高度親和力的磷脂結(jié)合蛋白，可作為探針識別膜表面是否有PS，從而識別凋亡細(xì)胞。PS外翻PI常用于鑒別死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完整的，所以PI不能進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞核內(nèi)。AnnexinV-FITCPI活細(xì)胞早期凋亡晚期凋亡壞死細(xì)胞裸核免疫熒光圖C1h2h3h4h5h細(xì)胞膜透性核酸染料，激發(fā)波長：488nm/633nm應(yīng)用：與PI染料共同標(biāo)記可用于細(xì)胞凋亡檢測原理：熒光強度

活細(xì)胞＞凋亡細(xì)胞＞死細(xì)胞活細(xì)胞：SYTOhighPI-早期凋亡細(xì)胞：SYTOdimPI-晚期凋亡（或壞死細(xì)胞）SYTOlowPI+PISYTO3.2.3細(xì)胞膜變化檢測-

SYTO/PI雙染法3.2.4線粒體膜電位檢測法凋亡細(xì)胞線粒體膜電位會發(fā)生改變，利用熒光探針羅丹明123(Rh123)、DiOC6和JC-1等標(biāo)記后，經(jīng)過流式能檢測出線粒體電位的變化，從而反映了細(xì)胞的凋亡情況。JC-1在正常細(xì)胞中在胞漿以聚合體形式存在，在Fl-1和Fl-2有熒光；細(xì)胞凋亡時線粒體膜電位發(fā)生去極化，JC-1進(jìn)入線粒體以單體形式存在，僅在Fl-1通道有熒光。JC-1(Fl-1)JurkatTCellsControl

CamptothecinJC-1(Fl-2)線粒體膜電位檢測數(shù)據(jù)分析：

圖片來源：中國流式協(xié)會網(wǎng)站論壇3.2.5DNA斷裂片段的檢測(TUNNEL法)凋亡中晚期會發(fā)生核酸內(nèi)切酶的激活，雙鏈的DNA出現(xiàn)不對稱的斷裂點，即產(chǎn)生一系列3’-OH端。加入外源性的脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)能夠催化外源性熒光素標(biāo)記的dUTP連接到DNA的3’-OH端，通過流式檢測就能知道DNA斷裂片段的多少，這種方法叫做TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TdTmediated-dUTPnickendlabeling,TUNEL)。近來研究證實，Br-dUTP(BrdU)更容易摻入到凋亡細(xì)胞的DNA中，所以現(xiàn)在流式中都先用BrdU進(jìn)行摻入反應(yīng)，然后使用熒光素標(biāo)記的BrdU抗體進(jìn)行細(xì)胞染色，流式檢測后得到凋亡結(jié)果。TUNEL法檢測凋亡原理Fas-inducedApoptosisinJurkatTCellsAnnexinV-FITCAnnexinV/PI雙染法PITUNEL法BrdU-FITC3.3檢測細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖(proliferation)是細(xì)胞生命活動的重要特征之一。檢測細(xì)胞增殖的方法主要有：MTT檢測法胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入法流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期法相對計數(shù)法/絕對計數(shù)法示蹤染料標(biāo)記法BrdU標(biāo)記法增殖蛋白檢測3.3.1示蹤染料標(biāo)記法示蹤染料能與細(xì)胞發(fā)生非特異性的穩(wěn)定結(jié)合，主要有兩種結(jié)合方式：一種進(jìn)入胞內(nèi)與蛋白質(zhì)共價結(jié)合，如CFSE和BRSE；另一種嵌入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，與細(xì)胞非共價結(jié)合，如PKH類和CellVue類等。CFSE標(biāo)記細(xì)胞后對細(xì)胞沒有很強毒性，被激發(fā)后能發(fā)出很強的熒光，并且非常穩(wěn)定，只有當(dāng)細(xì)胞分裂時，母細(xì)胞內(nèi)的染料會被平均分配到子細(xì)胞中，細(xì)胞的熒光信號減少一半。PMA刺激小鼠的脾細(xì)胞增殖圖Figure1:ExamplestainingdatafromDC-Tcellassay,(1)CFSE-labeledTcellsincubatedwithDCsthatwerenotco-culturedwithantigen,(2)CFSE-labeledTcellsincubatedwithDCsthathadbeenpreviouslyco-culturedwithwholeproteinantigen(Drug1),(3)CFSE-labeledTcellsincubatedwithDCsthathadbeenpreviouslyco-culturedwithcontrolantigen(TuberculinPPD).DC-Tcellco-cultureassay3.3.2BrdU標(biāo)記法5-溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)是胸腺嘧啶核苷的類似物，在細(xì)胞增殖DNA合成時可以與內(nèi)源性的胸腺嘧啶核苷競爭摻入到新合成的DNA中，而BrdU抗體可以特異性的識別BrdU，所以可以檢測細(xì)胞增殖。BrBrBrBranti-BrdUBrBrAcidorDNase打開雙鏈BrdU標(biāo)記時同時加入DNA染料(PI,7-AAD)，結(jié)果為一個典型的“馬蹄形”峰，不僅能得到G0/G1期、S期和G2/M期的比例，還能比較不同細(xì)胞DNA合成能力的不同。sub-G15.6%G0/G138.6%G2/M14.4%S期38.6%BrdU標(biāo)記法檢測細(xì)胞增殖的另一優(yōu)勢是：發(fā)揮流式多參數(shù)的特性，能和其他指標(biāo)同時檢測，既可以是表面抗原，也可以是胞內(nèi)蛋白。取致敏BALB/c小鼠脾臟細(xì)胞，體外刺激(PMA和離子霉素)后摻染BrdU45min，標(biāo)記anti-BrdU、7-AAD、CD8以及IL-10進(jìn)行多參數(shù)分析27%24%34%38%3.4免疫細(xì)胞亞型檢測CD分子是細(xì)胞(包括白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞等)在分化為不同譜系(lineage)、不同階段以及活化過程中或疾病狀態(tài)下出現(xiàn)或消失的細(xì)胞表面標(biāo)記。分化群(clusterofdifferentiation,CD)：一類分化抗原的總稱，進(jìn)行流水編號，至2009年已至少有350種CD分子。大多數(shù)白細(xì)胞分化抗原在生物進(jìn)化中具有保守性，但是有些小鼠白細(xì)胞分化抗原和人類還是有所不同：某些人CD分子尚未在小鼠中確定；某些人和小鼠CD分子編號相同，但功能有所差別。細(xì)胞群體人小鼠免疫細(xì)胞CD45+CD45+T淋巴細(xì)胞CD3+CD3+B淋巴細(xì)胞CD19+、CD20+B220(CD45R)+NK細(xì)胞CD56+CD335(NKp46)+單核細(xì)胞CD14+Mac-1+紅細(xì)胞CD235a+Ter119+造血干細(xì)胞Lin-CD34+CD38-Lin-Sca-1+CD117+免疫細(xì)胞特征表型Lin為譜系標(biāo)記Lineagemarker，是造血細(xì)胞來源的各種血細(xì)胞和免疫細(xì)胞特異性標(biāo)記的總稱。Lin雖然包括很多種抗體，干細(xì)胞鑒定時，可能把它們標(biāo)上同一種熒光素，只需分配一個流式通道。各流式抗體公司一般都有用于流式的lineagecocktail。GranulocytesMonocytesEosinophilsBasophilsNeutrophilsLymphocytesTBNKPeripheralWhiteBloodCellsCD45+THelperCD3+CD4+TCytotoxicCD3+CD8+CD3+CD3-CD19+CD3-CD16+CD56+MonocytesCD14+TypeofcellsCytotoxicTh1Th2Th17TregTfhMainfunctionKillvirus-infectedcellsActivateMacandhelpBcellsHelpBcellsandswitchantibodyEnhanceneutrophilresponseImmuneregulationBcelldevelopmentantibodyDiseaseinfectionIntracellularpathogenparasitesFungiandextracellularbacteriaAutoimmuneandcancerautoimmuneSurfaceMarkersCD8CD4CXCR3CD4,CCR4,CRTH2CD4,CCR6CD4,CD25CD4,CXCR5EffectorcytokinesIFNg,TNFIFNg,TNFIL-4,5,13Il-17A,FTGFb,IL-10IL-21TranscriptionfactorsT-betGATA3RORrtFoxP3Bcl-6TcellsubsetsandmarkersMarkerFluorochromePurposeViabilitydyeV500ViabilityCD3PerCP-Cy5.5TcellmarkerCD4BUV395TcellsubsetCD8FITCTcellsubsetCD127Alex647TregmarkerHLA-DRAPC-H7ActivationCD45ROPE-Cy7MemoryCD197(CCR7)BV421Na?veCD38BV605ActivationCD27BV786MemoryCD25PE-CF594TregmarkerCD196(CCR6)PETh17markerCXCR3Alex700Th1markerSurfaceMarkersforTcellsubsets3.4.1淋巴細(xì)胞亞群分析根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為：T淋巴細(xì)胞(CD3+)，與細(xì)胞免疫有關(guān)；輔助性T細(xì)胞(CD3+CD4+)：helperTcells，Th細(xì)胞；細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD3+CD8+)：CytotoxicTcells，Tc細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞(CD19+)，與體液免疫有關(guān)；NK細(xì)胞(CD3-CD16+CD56+)，行使免疫監(jiān)控功能，能夠介導(dǎo)對某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用?？俆、總B和NK細(xì)胞的比例以及Th/Tc可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。FSCSSCCD3PerCPSSCCD4FITCCD8PE42.04%48.3%1.8%13.9%35.9%T淋巴細(xì)胞亞群分析CD3PerCPCD4FITCCD8PE42.82%37.41%49.68%T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞比例檢測亞群百分比(％)絕對計數(shù)(個/ul)總T細(xì)胞(CD3+)50-84955-2860總B細(xì)胞(CD3-CD19+)5-1890-560NK細(xì)胞(CD3+/CD16+CD56+)7-40150-1100健康成年人外周血淋巴細(xì)胞參考范圍人外周血淋巴細(xì)胞分析3.4.2樹突狀細(xì)胞樹突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)是機體功能最強的專職抗原遞呈細(xì)胞，它能高效攝取、加工處理和遞呈抗原。根據(jù)DC來源可將DC分為髓樣DC(myeloidDC,mDC)和漿細(xì)胞樣DC(plasmacytoidDC,pDC)。mDC主要由CD34+細(xì)胞和單核細(xì)胞分化而來，特征性標(biāo)志為CD11c。pDC與淋巴細(xì)胞來源于同一前體細(xì)胞，特征性標(biāo)志為CD123。一般認(rèn)為：mDC表型為：Lin-/lowHLA-DR+CD11c+CD123-；pDC表型為：Lin-/lowHLA-DR+CD11c-CD123+。（Lin包括CD3、CD14、CD16/56和CD19/20）FSC-HeightSSC-HeightLin-FITCHLA-DRPerCPCD123PECD11cAPCR1R2R30.16%R4IdentificationofpDCinPBMCJImmunol.2004;173:1535-1548mDCpDCGM-CSF和IL-4分選誘導(dǎo)分化LPS或TNF-

α促成熟CD14+MonocyteImmaturedendriticcellmaturedendriticcellMonocyte-DerivedDendriticCell3.4.3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcell,Treg)是在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，屬于一種免疫耐受的細(xì)胞，已成為目前免疫學(xué)領(lǐng)域研究的熱門課題。目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種表型的Treg存在，一般認(rèn)為Treg是指表達(dá)特征為CD4+CD25+Foxp3+的一群T淋巴細(xì)胞。Foxp3是Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志，它是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著Treg分化發(fā)育及功能維持。胞內(nèi)染色法才能檢測，不能用于分選。FSCSSCCD4FITCSSCCD25APCIgG1PECD25APCFoxp3PETreg細(xì)胞設(shè)門方法FSCCD3FITCCD25PESSCCD4PerCP-Cy5.5CD127APC以前根據(jù)CD4+CD25high來分選Treg。最近發(fā)現(xiàn)，CD127(IL-7受體)在Treg中低表達(dá)，因此CD127可以作為Treg比較理想的表面標(biāo)記分子，以CD4+CD25int/highCD127low作為Treg的標(biāo)志。CD4、CD25、CD127三標(biāo)法分選Treg細(xì)胞3.4.4CD34+絕對計數(shù)與造血干細(xì)胞移植外周血干細(xì)胞移植時，采集物中造血干細(xì)胞的數(shù)量對移植的成功有著直接的影響，因此有必要準(zhǔn)確測定造血干細(xì)胞的絕對數(shù)量。CD34是目前應(yīng)用最多的干細(xì)胞表面標(biāo)記，采用流式細(xì)胞術(shù)快速定量CD34+細(xì)胞，被臨床上廣泛采用。其基本原理都是加入一定量的微球作為內(nèi)參，通過已知濃度的微球測定CD34+細(xì)胞的絕對值。絕對計數(shù)管CD34+細(xì)胞絕對計數(shù)計算公式：CD34+細(xì)胞絕對值＝(獲取CD34+細(xì)胞數(shù)/獲取微球數(shù))×(每管微球數(shù)/標(biāo)本體積)3.5檢測細(xì)胞因子細(xì)胞因子(cytokine)是一類能在細(xì)胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)等功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽。根據(jù)功能可以分為6大類：白細(xì)胞介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、生長因子和趨化因子

。細(xì)胞因子的檢測方法：ELISA流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)細(xì)胞因子：胞內(nèi)染色法(intracellularstainingassay)；胞間細(xì)胞因子：CBA法(cytometricbeadassay,流式微球陣列)3.5.1胞內(nèi)因子檢測目的：檢測胞內(nèi)因子，結(jié)合膜表面抗原，可以對免疫細(xì)胞進(jìn)行分類，Th1、Th2和Th17。Th細(xì)胞根據(jù)分泌細(xì)胞因子能力的不同，分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。細(xì)胞免疫體液免疫目前并沒有找到公認(rèn)的細(xì)胞表面鑒別標(biāo)志，所以仍以分泌的細(xì)胞因子來區(qū)分Th1和Th2細(xì)胞：Th1：CD4+IFN-γ+Th2：CD4+IL-4+Tc1：CD8+IFN-γ+Tc2：CD8+IL-4+Th17是最近發(fā)現(xiàn)的一種效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞，以分泌IL-17為特征。Th17：CD4+IL-17+檢測原理活化：自然狀態(tài)下，靜止的淋巴細(xì)胞不分泌或者分泌極少量細(xì)胞因子，刺激激活后，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子合成增加。常用的刺激劑有佛波酯PMA、離子霉素(Inomycin)、ConA、PHA、LPS等。抑制分泌：細(xì)胞因子合成后很快就主動分泌到細(xì)胞外，位于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子的量很少，一般無法達(dá)到流式分析檢測的最低標(biāo)準(zhǔn)，因此必須阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外。蛋白質(zhì)分泌抑制劑如莫能霉素(monensin)、BFA(brefeldinA)能抑制細(xì)胞因子分泌，使其累積在細(xì)胞內(nèi)。檢測步驟(以檢測全血Th1/Th2為例)取抗凝血和培養(yǎng)基1:1等體積稀釋，加入刺激劑PMA、離子霉素和阻斷劑莫能霉素，37℃、5%培養(yǎng)箱4-6h；取200ul，溶血后用PBS洗一遍；細(xì)胞表面染色：

加PerCP-CD3和APC-CD8室溫孵育20min(PMA刺激后CD4分子會被內(nèi)吞減少)；固定、破膜后加PBS洗一遍；細(xì)胞內(nèi)染色：加入熒光抗體FITC-IFN-γ和PE-IL-4，混勻后避光孵育30min；加2ml洗液，離心棄上清，加200ulPBS重懸細(xì)胞上機檢測。吸毒人外周血Th1/Th2和Tc1/Tc2比例檢測Th2Tc2Tc1Th13.5.2CBA法CBA(cytometricbeadarray,流式微球陣列)是新發(fā)展起來的能定量檢測胞外游離可溶性成分(如細(xì)胞因子等)的新方法。CBA應(yīng)用領(lǐng)域包括血清、血漿、淚液等體液標(biāo)本以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中多種可溶性成分的檢測。技術(shù)優(yōu)點：能同時檢測多種目的蛋白；樣本需求量??；更高的靈敏度和更好的重復(fù)性；操作簡單省時省力。+BeadCaptureAbCaptureBeadcytokineDetectionAbCBA技術(shù)原理微球上包被細(xì)胞因子抗體后形成捕獲微球(capturebead)，捕獲微球上的捕獲抗體(captureantibody)能與樣本中相應(yīng)的細(xì)胞因子特異性結(jié)合。這樣捕獲了細(xì)胞因子的微球就類似于一個細(xì)胞，加入相應(yīng)的熒光素檢測抗體形成“三明治”式夾心復(fù)合物，上流式后就能得到細(xì)胞因子的含量。CBA微球是包被有熒光染料的，一系列熒光強度不同的微球就能同時檢測多種細(xì)胞因子。PE-Cy5PEIL-2IL-4IL-8PEPE-Cy5IL-2IL-4IL-8CBAkit中含有已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，測定前將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。0pg/mL80pg/mL1250pg/mL5000pg/mLFL3BeadsIL-2IL-4IL-6IL-10TNFIFN-rIFN-rTNF-aIL-10IL-6IL-4IL-2CBA

humanTh1/Th2cytokinekit標(biāo)準(zhǔn)曲線PEPE-Cy53.6檢測細(xì)胞吞噬功能巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等都具有很強的吞噬功能，檢測吞噬功能是免疫學(xué)研究的重要內(nèi)容。把細(xì)菌或者吞噬顆粒標(biāo)上熒光后，與目標(biāo)細(xì)胞在37℃作用一段時間，流式細(xì)胞儀檢測熒光信號的強弱就可以區(qū)分目標(biāo)細(xì)胞是否具有吞噬功能以及吞噬功能的強弱。Blood.2008;112:3175-3185實驗組：LRDC和cDC與FITC偶聯(lián)的BSA在37℃作用4h；對照組：LRDC和cDC與FITC偶聯(lián)的BSA在4℃作用4h；LRDC的吞噬功能要強于cDC。BSA-FITCCounts3.7流式分選

3.7.1免疫細(xì)胞亞群分選3.7.2GFP陽性穩(wěn)轉(zhuǎn)株分選3.7.3干細(xì)胞分選

（一）造血干細(xì)胞分選（二）腫瘤干細(xì)胞分選

（三）

側(cè)群細(xì)胞分選3.7.