幽門(mén)螺桿菌黏唾液酸黏附素疫苗治療小鼠幽門(mén)螺桿菌感染

幽門(mén)螺桿菌黏唾液酸黏附素疫苗治療小鼠幽門(mén)螺桿菌感染【摘要】目的:利用人類幽門(mén)螺桿菌()感染的小鼠模型研究唾液酸黏附素疫苗治療感染的作用.方法：把已感染的小鼠分成4組,分別通過(guò)灌胃方法給予唾液酸黏附素100μg加霍亂毒素CT2μg、單純唾液酸黏附素100μg、單純CT2μg或PBS,1次/wk,共4次,治療結(jié)束后4wk處死動(dòng)物,取胃粘膜行半定量細(xì)菌培養(yǎng)檢查情況.結(jié)果：治療后各組根除率分別為:唾液酸黏附素加CT組30%、單純唾液酸黏附素組、單純CT組及PBS組根除率均為0%.差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.未根除的小鼠，唾液酸黏附素加CT組的定植密度明顯低于其它3組.結(jié)論：唾液酸黏附素能夠作為多價(jià)治療疫苗的組分之一.

【關(guān)鍵詞】幽門(mén)螺桿菌；唾液酸黏附素；克??；免疫；疫苗

ImmunizationtreatmentofHelicobacterpyloriinfectionwiththevaccinecomposedofsialicacidadhesinandCT:Ananimalmodelstudy

【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectsofthevaccineconsistingofHelicobacterpylori()sialicacidadhesinandcholeratoxin(CT)inthetreatmentofinfectioninainfectedmousemodel.METHODS:TheC57BL/6miceinfectedwithweredividedinto4groups.Themiceofeachgroupwereimmunizedbysialicacidadhesin(100μg)plusCT(2μg),sialicacidadhesin(100μg),CT(2μg),PBSorallyrespectively,onceaweekfor4weeks.Fourweeksafterlasttreatment,allanimalsweresacrificedandstomachbiopsieswerecollectedtodetectbythesemiquantitativebacterialcultureassay.RESULTS:Theeradicationrateofthevaccinegroupwas30%.Theeradicationratesoftheother3groupswereall0%.Thereweresignificantdifferencesintheeradicationrateamongthevaccinationgroupandtheother3controlgroups().Inaddition,thecolonizeddensityofvaccinationgroupwassignificantlylowerthanthatofother3groups().CONCLUSION:Sialicacidadhesincouldbeaneffectivecomponentofmultivalencevaccine.

【Keywords】Helicobacterpylori;sialicacidadhesin;cloning;immune;vaccine

0引言

我們已經(jīng)構(gòu)建了幽門(mén)螺桿菌唾液酸黏附素的高效原核表達(dá)體系［1-2］，并對(duì)其進(jìn)行了純化及功能研究［3］.現(xiàn)通過(guò)建立感染的小鼠模型觀察唾液酸黏附素疫苗治療感染的作用，為多價(jià)治療性疫苗的研制奠定基礎(chǔ).

1材料和方法

材料無(wú)特定病原體C57BL/6小鼠30只，4wk齡，雄性，質(zhì)量12~13g，飼養(yǎng)條件符合2級(jí)動(dòng)物要求.純化的重組唾液酸黏附素在以前的研究中已經(jīng)制備；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純.的固體培養(yǎng)：取冷凍保存的菌種一環(huán)于固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線接種，2h內(nèi)置厭氧培養(yǎng)箱，37℃微需氧環(huán)境中培養(yǎng)72h，濕度保持95％以上.的菌落呈園形，凸起、光滑、灰白色、半透明，直徑~mm左右.液體培養(yǎng)：取固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落至布氏肉湯中，抽濾瓶抽氣換氣2次以滿足微需氧條件，恒溫振蕩培養(yǎng)120r/min培養(yǎng)48~72h.的鑒定包括菌落形態(tài)、涂片觀察、尿素酶實(shí)驗(yàn).灌胃用的要求：革蘭氏染色陰性，形態(tài)呈S形、螺旋形、桿狀，暗視野下有活力，不含雜菌，密度約為1012/L.

感染小鼠模型的建立:采用參考文獻(xiàn)［4］方法馴化ss1株，分離可在小鼠胃內(nèi)穩(wěn)定定植的ss1株，固體培養(yǎng)2~3d，菌落經(jīng)鑒定后用布氏肉湯洗下，調(diào)整細(xì)菌濃度至1012CFU/L，每只小鼠灌胃mL.所有動(dòng)物灌胃前禁食12h，禁水4h.灌胃后禁食2h.連續(xù)5次，1wk完成.采用胃管法以確保灌入胃內(nèi).末次灌胃后4wk隨機(jī)處死5只小鼠，剖腹取胃，沿縱軸將胃切為3部分，一份行快速尿素酶試驗(yàn)，一份置40g/L甲醛固定供組織學(xué)檢查，一份細(xì)菌培養(yǎng)，檢查是否感染

方法將已鑒定感染的剩余的25只小鼠隨機(jī)分成4組：①疫苗組：經(jīng)口喂飼唾液酸黏附素100μg加霍亂毒素2μg；②單純唾液酸黏附素疫苗組：經(jīng)口喂飼唾液酸黏附素100μｇ；③單純霍亂毒素組：經(jīng)口喂飼ＣＴ2μｇ；④PBS組：經(jīng)口喂飼PBS200μg/鼠/次.治療組10只小鼠:后3組為對(duì)照組，每組5只小鼠.免疫治療前小鼠禁食12h，禁水4h.每只小鼠先用30g/L碳酸氫鈉100μL灌胃以中和胃酸，10min后分別按上述分組灌胃，30min后再給小鼠提供水和食物.隔周免疫，加強(qiáng)免疫3次，劑量同前.末次免疫后4wk，禁食1d，摘眼球放血處死動(dòng)物，用750g/L乙醇浸泡小鼠體表5min以上.在超凈工作臺(tái)內(nèi)迅速取出胃用于免疫治療后幽門(mén)螺桿菌根除的鑒定，方法采用半定量細(xì)菌培養(yǎng)法［5］，胃組織稱重后，制成勻漿，用布氏肉湯倍比稀釋后，取200μL涂于固體培養(yǎng)基，菌落計(jì)數(shù)后，計(jì)算單位胃組織的定植細(xì)菌密度.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用軟件，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料的比較采用方差分析，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

經(jīng)尿素酶實(shí)驗(yàn)、組織病理學(xué)檢查及細(xì)菌培養(yǎng)證實(shí)5只隨機(jī)處死的小鼠全部感染細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)胃組織的定植密度為105-6/g.胃組織培養(yǎng)為陰性者定為根除，疫苗治療組10例中有3例根除，根除率為30%，其它3組無(wú)1例根除，根除率為%.未根除的小鼠，我們進(jìn)行了定植密度的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)疫苗治療組的定植密度為×10e-6菌落形成單位/克胃組織，明顯低于其它3組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義口服免疫已感染的恒河猴，大多數(shù)動(dòng)物胃內(nèi)定植密度減少且胃炎明顯好轉(zhuǎn)［6-7］；免疫治療已成為治療感染最有效、最有前景的方法之一.同時(shí)也提示單一尿素酶抗原免疫不能達(dá)到最佳的治療效果，為了確保免疫治療效果必須尋找其它有效抗原成分來(lái)配制更有效的多價(jià)疫苗.在疫苗候選成分的研制過(guò)程中，目前采用的基因重組抗原尿素酶、過(guò)氧化氫酶、細(xì)胞空泡毒素等，基本上著眼于阻斷的毒力因素，而與Hp定植密切相關(guān)的黏附素評(píng)價(jià)較少.如從黏附素出發(fā)尋找保護(hù)性抗原也許是一種有益的嘗試.唾液酸黏附素是近年來(lái)研究中新確定的功能蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量約17500，能夠結(jié)合含唾液酸的鞘糖脂和胎球蛋白瓊脂糖.在其它病原微生物的研究中如諾瓦克病毒，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NV能夠與人的唾液相結(jié)合，進(jìn)一步研究表明，與NV相結(jié)合的唾液中所含的受體廣泛存在于人體的消化道黏膜表面，NV通過(guò)與這些受體結(jié)合從而定植于人體，才能進(jìn)一步發(fā)揮其致病作用，因此，能夠與這些受體相結(jié)合的NV蛋白配體是重要的功能蛋白［8-9］.由此，我們推測(cè)唾液酸黏附素這種新的功能蛋白也許在致病作用中也發(fā)揮著同樣重要的作用.從它出發(fā)制備疫苗可能為多價(jià)疫苗提供新的組分.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，唾液酸黏附素疫苗的根除率為30%，即使未根除的小鼠，其定植密度也有明顯的降低，可用于治療性疫苗候選抗原.未來(lái)的疫苗可能是針對(duì)自我防護(hù)因素、毒力因素、黏附因素等多種因素所構(gòu)成的多價(jià)疫苗，唾液酸黏附素可能在其中發(fā)揮重要的作用.

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