干細(xì)胞的研究進(jìn)展

干細(xì)胞的研究進(jìn)展【摘要】干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群體。近年來干細(xì)胞的應(yīng)用幾乎涉及到所有生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本文概述了干細(xì)胞的生物學(xué)特性，并綜述了干細(xì)胞的可塑性、分離培養(yǎng)及其在基礎(chǔ)研究及臨床上的應(yīng)用的研究進(jìn)展。最后，展望了今后研究的方向。

【關(guān)鍵詞】干細(xì)胞；生物學(xué)特性；可塑性；分離培養(yǎng)；應(yīng)用

Advancesinstudyofstemcells

【Abstract】Stemcellsarenon-specializedcellswhichhavetheabilityofself-renewalandmultipledifferentiationpotential.Theapplicationofstemcellshasnearlyinvolvedinalltheresearchfieldonlifesciencesandbiomedicineinrecentyears.Thisarticlesummarizesthebiologicalcharacteristicofstemcells,andreviewsthelatestprogressinthestudyonstemcell’splasticity,isolation,cultureinvitro,anditsextensiveapplicationinbasicresearchandclinicalapplication.Theprospectsofstemcellsarealsodiscussed.

【Keywords】stemcells;biologicalcharacteristic;plasticity;isolation;cultureinvitro;application

干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體，即這些細(xì)胞可以通過細(xì)胞分裂維持自身細(xì)胞群的大小，同時(shí)又可以進(jìn)一步分化成為各種不同的組織細(xì)胞，從而醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細(xì)胞”。1981年英國的Evans和Kaufman用延緩著床的胚泡首次成功地分離了小鼠胚胎干細(xì)胞,從而在全球掀起了有關(guān)干細(xì)胞的研究熱潮。1997年2月英國蘇格蘭羅斯林研究所威爾穆特博士等成功克隆出“多利”綿羊，1998年11月,美國Thomson［1］和Gearhart［2］分別用不同的方法獲得人胚胎干細(xì)胞及胚胎生殖細(xì)胞,此后,干細(xì)胞的研究便進(jìn)入了一個(gè)全新的時(shí)代。1999年，有關(guān)干細(xì)胞的研究被Science評為1999年度十大科學(xué)進(jìn)展之首。2000年12月干細(xì)胞研究再次被《科學(xué)》雜志評為該年度世界十大科學(xué)成就之一。本文就近幾年來干細(xì)胞的研究進(jìn)展綜述如下。

1干細(xì)胞的生物學(xué)特性

根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育階段，可將其分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞即具有分化為機(jī)體任何一種組織器官潛能的細(xì)胞,包括胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞。成體干細(xì)胞即具有自我更新能力,但通常只能分化為相應(yīng)組織器官組成的“專業(yè)”細(xì)胞,它是存在于成熟個(gè)體各種組織器官中的干細(xì)胞,包括神經(jīng)干細(xì)胞、血液干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、肝干細(xì)胞等。

胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性胚胎干細(xì)胞最早是直接從小鼠早期胚胎分離建系的,它們具有其自身的生物學(xué)特性。與其他細(xì)胞系相比較,胚胎干細(xì)胞的特點(diǎn)在于:具有不斷增殖分化的能力，所以，在體外培養(yǎng)條件下可以建立穩(wěn)定的干細(xì)胞系，并保持高度未分化狀態(tài)和發(fā)育潛能性。1999年Soiter等［3］利用這個(gè)特性將ES/EBs及其分化細(xì)胞作為有關(guān)藥物的針對篩選系統(tǒng),進(jìn)行藥物毒性檢測實(shí)驗(yàn)。具有高度的發(fā)育潛能和分化潛能。體內(nèi)外可分化出外、中、內(nèi)三個(gè)胚層的分化細(xì)胞，可以誘導(dǎo)分化為成體細(xì)胞內(nèi)各種類型的組織細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞含有正常二倍染色體，具有種系傳遞功能,能廣泛參與宿主胚胎各組織器官的生長發(fā)育,并形成包括生殖系在內(nèi)的合體后代生殖細(xì)胞。1995年P(guān)acacio等［4］利用骨髓基質(zhì)細(xì)胞或其培養(yǎng)液,將胚胎干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化為造血干細(xì)胞。1997年Baker等［5］在缺乏新霉素(geneticin,g418)的條件下,將Rosaβ-geo基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞后能在體外誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞。同年Deni等報(bào)告將胚胎干細(xì)胞通過懸滴培養(yǎng)可分化出脂肪細(xì)胞。能進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增,還可以對其進(jìn)行遺傳操作選擇,如導(dǎo)入異源基因、報(bào)告基因或標(biāo)志基因，誘導(dǎo)某個(gè)基因突變等。擴(kuò)增、遺傳操作及凍存均不喪失其多能性。凍存的細(xì)胞可在需要時(shí)隨時(shí)解凍,繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特性。

成體干細(xì)胞的生物學(xué)特征干細(xì)胞在分化為特化細(xì)胞之前常產(chǎn)生一種或幾種祖細(xì)胞，然后由祖細(xì)胞分化產(chǎn)生特化細(xì)胞。與胚胎干細(xì)胞相比較，成體干細(xì)胞有以下幾個(gè)特點(diǎn)：(1)成體干細(xì)胞體積小，細(xì)胞器稀少，RNA含量較低，在增殖過程中處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，在組織結(jié)構(gòu)中位置相對固定。(2)成體干細(xì)胞數(shù)量很少，其基本功能是參與組織更新，創(chuàng)傷修復(fù)及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究結(jié)果表明，即使在含量豐富的骨髓中，每10，000～15，000個(gè)骨髓細(xì)胞中只有一個(gè)造血干細(xì)胞［6］，人和動(dòng)物皮膚中的干細(xì)胞含量僅為7%～8％［7］。Reynolds等［8］實(shí)驗(yàn)證明成體哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量極少，僅占室下帶區(qū)中相對靜止細(xì)胞數(shù)的%～1%。(3)成體干細(xì)胞常處于一個(gè)有干細(xì)胞細(xì)胞基質(zhì)，對干細(xì)胞的增殖和分化起調(diào)控作用的各種信號分子的特定微環(huán)境或稱生物位中，干細(xì)胞是自我復(fù)制還是分化為功能細(xì)胞取決于所在的微環(huán)境和自身的功能狀態(tài)。(4)成體干細(xì)胞沒有確定的來源。有科學(xué)家推測，成體干細(xì)胞是胚胎發(fā)育過程中保存下來的未分化的細(xì)胞［6］，這揭示成體干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞可能會(huì)有

干細(xì)胞的可塑性主要是指成體干細(xì)胞的可塑性。人們把成體干細(xì)胞具有分化為其他類型組織細(xì)胞的能力的這種現(xiàn)象稱為干細(xì)胞的可塑性［9］，橫向分化［10］或轉(zhuǎn)決定［11］。

1995年，Pereira等［12］證明，小鼠骨髓細(xì)胞在體外培養(yǎng)后具有向骨、軟骨和肺基質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力。1999年,Bjornson等［13］將胚胎和成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞,以及在體外克隆的神經(jīng)干細(xì)胞移植給亞致死劑量照射的小鼠,結(jié)果證明神經(jīng)干細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為造血細(xì)胞。同年Jackson等［14］用Hoechst333422-lowSP純化的小鼠造血干細(xì)胞進(jìn)一步證明它可遷移到肌肉損傷部位,在參與肌肉再生的同時(shí)也參與血管的再生。2002年Vescovi等［15］報(bào)道神經(jīng)干細(xì)胞除有向神經(jīng)元、星形細(xì)胞與少突膠質(zhì)細(xì)胞分化能力以外,還可分化為造血細(xì)胞譜系。

肝干細(xì)胞也是干細(xì)胞可塑性的主要可靠證據(jù)之一。2000年Alison等［16］和Lagasse等［17］分別報(bào)道HSC可在體內(nèi)分化成肝細(xì)胞。2001年Shen等［18］在骨髓移植的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),肝臟干細(xì)胞能表達(dá)供體造血細(xì)胞的遺傳標(biāo)志。

這一系列的證據(jù)表明干細(xì)胞存在可塑性。然而，近幾年來，部分研究學(xué)者對干細(xì)胞的可塑性提出了不同的看法:(1)細(xì)胞自發(fā)融合導(dǎo)致“可塑性”。英國科學(xué)家2002年,Ying等［19］的研究結(jié)果表明,胚胎干細(xì)胞在體外與神經(jīng)或HSC共同培養(yǎng)時(shí),能自發(fā)地發(fā)生神經(jīng)或HSC與胚胎干細(xì)胞之間的融合,誘導(dǎo)NSC或HSC“橫向分化”為胚胎樣干細(xì)胞,然后展現(xiàn)出胚胎干細(xì)胞的表型特征與相應(yīng)功能。同年美國科學(xué)家Terada等［20］用充分的證據(jù)證明,骨髓細(xì)胞的多向分化是因?yàn)榕c胚胎干細(xì)胞融合所致,而不是骨髓細(xì)胞直接橫向分化的結(jié)果。這兩者的研究結(jié)果都表明，是由于發(fā)生了細(xì)胞融合，使所謂的成年組織干細(xì)胞具有了“可塑性”潛能。(2)成體干細(xì)胞的橫向分化是成體組織中余存的胚胎原始干細(xì)胞所致。2002年Jiang等［21］的研究結(jié)果證實(shí),在成體組織中余存著一種數(shù)量稀少的胚胎樣原始干細(xì)胞,表達(dá)胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志如Oct-4、Rex-1及SSEA-1,體外培養(yǎng)條件也類似于胚胎干細(xì)胞,所謂的成體組織干細(xì)胞的“可塑性”很可能是這些細(xì)胞所為。(3)2002年，在Science和Nature上連續(xù)刊發(fā)的幾篇文章指出，成體干細(xì)胞可塑性可能是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不嚴(yán)謹(jǐn)，判斷錯(cuò)誤所致，認(rèn)為所謂的成體干細(xì)胞可塑性缺乏科學(xué)依據(jù)。

3干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

由于干細(xì)胞的數(shù)目很少，因此需要在體外對干細(xì)胞進(jìn)行非分化性增殖。干細(xì)胞的分離培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)是其生物學(xué)特征，包括形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征及其生物學(xué)表型。

干細(xì)胞的分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)主要是建立在老鼠的實(shí)驗(yàn)上，早在二十世紀(jì)七八十年代就已從小鼠中分離出胚胎干細(xì)胞并在體外進(jìn)行培養(yǎng)成功。近年來，國內(nèi)在這方面的研究也取得了一定的進(jìn)展，主要是在神經(jīng)干細(xì)胞等成體干細(xì)胞的研究上。2002年陳雷等［22］應(yīng)用無血清培養(yǎng)技術(shù)從胎鼠脊髓分離到的神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞具有不斷分裂增殖的能力,可被神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗體所標(biāo)記,并在血清條件下分裂為神經(jīng)系統(tǒng)多種細(xì)胞。2004年馮玉萍等［23］用胰酶消化加機(jī)械吹打分離大鼠大腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下組織,之后用懸浮培養(yǎng)法、有限稀釋法獲得來源于同一細(xì)胞的亞細(xì)胞系克隆;2005年肖美玲等［24］用同樣的方法分離新生昆明種小鼠(出生24h內(nèi))的大腦組織，利用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,獲得具有自我增殖能力的細(xì)胞克隆,兩者經(jīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定為神經(jīng)干細(xì)胞。

雖然老鼠的干細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)取得了可喜的進(jìn)展，但人的干細(xì)胞的體外培養(yǎng)直到1995年,Thomson等從恒河猴的囊胚中分離,建立了第一個(gè)靈長類動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞株后，才獲得成功并得到迅速的發(fā)展。1998年,Thomson［1］和Gearhart［2］分別用胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞建立了人的胚胎干細(xì)胞系,在體細(xì)胞與生殖細(xì)胞間架起了橋梁,為研究胚胎干細(xì)胞的發(fā)育,在體外培養(yǎng)人體細(xì)胞和組織,利用ES細(xì)胞治療疾病提供了廣闊的發(fā)展前景。在報(bào)道分離了人的胚胎干細(xì)胞這一重大成果后不久,美國AdvanceCellTechnology(ACT,Worcester,M)的研究者宣稱,他們通過使人的皮膚細(xì)胞和牛的卵細(xì)胞雜交,培育出了人的胚胎干細(xì)胞。所用的方法與克隆實(shí)驗(yàn)中采用的方法相似,基本上是對人的細(xì)胞重新編程并使其回到它最初的原始狀態(tài)。該發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致許多新方法的產(chǎn)生,如通過移植和細(xì)胞治療來醫(yī)治疾病。2002年李巍等［25］采用無血清培養(yǎng)技術(shù),成功地分離培養(yǎng)了人胚胎大腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞，且能被誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)傳12代后仍具干細(xì)胞特性。2004年王共先等［26］以器官捐獻(xiàn)者的正常前列腺為研究對象,利用免疫磁珠細(xì)胞成功從前列腺基底細(xì)胞中分離前列腺干細(xì)胞。同年汪泱等［27］和羅樹偉等［28］均成功分離培養(yǎng)了人胚腦神經(jīng)干細(xì)胞，并進(jìn)行進(jìn)一步的檢測和研究。

4干細(xì)胞的應(yīng)用

胚胎干細(xì)胞是細(xì)胞的源頭,具有多能或全能性,并能夠無限分化,能夠制造機(jī)體需要的全部細(xì)胞,因此在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)上具有巨大潛力,應(yīng)用前景廣闊。但它存在著移植免疫排斥的限制和倫理學(xué)方面的困擾,而成體干細(xì)胞只能在體外有限擴(kuò)增,多系分化效力低,通過體外的擴(kuò)增培養(yǎng)雖能夠提高轉(zhuǎn)化效率,然而體外轉(zhuǎn)化是否會(huì)引起干細(xì)胞遺傳特性的改變尚不清楚。但這類干細(xì)胞存在于宿主體內(nèi),可直接從患者自身獲得,故無移植免疫排斥的限制也無倫理學(xué)方面的困擾,因此胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的研究對生命科學(xué)領(lǐng)域而言,都具有極重要的意義。

為發(fā)育生物學(xué)研究提供良好的體外模型系統(tǒng)哺乳動(dòng)物胚胎體積較小，而且在子宮內(nèi)進(jìn)行發(fā)育，因此很難在動(dòng)物體內(nèi)連續(xù)動(dòng)態(tài)地研究其早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞組織分化及基因表達(dá)調(diào)控，而來源于胚胎的胚胎干細(xì)胞具有發(fā)育全能性、可操作性及無限擴(kuò)增的特性，因此胚胎干細(xì)胞提供了在細(xì)胞和分子水平上研究個(gè)體發(fā)育過程中極早期事件的良好材料和方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過比較胚胎干細(xì)胞不同發(fā)育階段的干細(xì)胞和分化細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，可確定胚胎發(fā)育及細(xì)胞分化的分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新基因。結(jié)合基因打靶技術(shù)，可發(fā)現(xiàn)不同基因在生命活動(dòng)中的功能等。

在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用理論上講，干細(xì)胞可以用于臨床細(xì)胞移植治療各種疾病和構(gòu)建人工組織或器官，其最適合的疾病主要是組織壞死性疾病如缺血引起的心肌壞死、腫瘤，退行性病變?nèi)缗两鹕C合征，自體免疫性疾病如胰島素依賴型糖尿病等。應(yīng)用干細(xì)胞治療疾病較傳統(tǒng)方法具有很多優(yōu)點(diǎn)：低毒性或無毒性，一次藥有效；不需要完全了解疾病發(fā)病的確切機(jī)理；不存在傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)：還可能應(yīng)用自身干細(xì)胞移植，避免產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。

1999年Horwitz等［29］用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療遺傳性骨缺陷病，并取得了一定效果。2004年9月，意大利一名5歲、患有地中海貧血癥的男孩盧卡，科學(xué)家通過從其弟弟的胎盤血中提取干細(xì)胞移植到盧卡身上，使其戰(zhàn)勝病魔，完全治愈。

生產(chǎn)克隆動(dòng)物的高效材料胚胎干細(xì)胞是動(dòng)物克隆的優(yōu)良核供體。胚胎干細(xì)胞可以無限傳代和增殖而不失去其基因型和表現(xiàn)型,以其作為核供體進(jìn)行核移植后在短期內(nèi)可獲得大量基因型和表現(xiàn)型完全相同的個(gè)體。胚胎干細(xì)胞與胚胎嵌合生產(chǎn)克隆動(dòng)物可解決哺乳動(dòng)物遠(yuǎn)緣雜交的困難問題。另外,由于體細(xì)胞克隆動(dòng)物存在成功率低、早衰、易缺陷易突變等問題，且多是致命的,使胚胎干細(xì)胞的克隆研究仍十分重要。1999年Wakayaama等［30］用長期傳代的小鼠胚胎干細(xì)胞克隆出31只小鼠，14只存活，存活率比體細(xì)胞克隆高。

高效新型藥物的發(fā)現(xiàn)、篩選及動(dòng)物和人類疾病的模型胚胎干細(xì)胞提供了新藥物的藥理藥效、毒理及藥物代謝等研究的細(xì)胞水平的研究手段，利用胚胎干細(xì)胞體外分化的細(xì)胞組織檢驗(yàn)篩選新藥，可大大減少藥物實(shí)驗(yàn)所需實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量及其人群數(shù)量，胚胎干細(xì)胞還可用來研究動(dòng)物和人類疾病的發(fā)生機(jī)制和發(fā)展過程以便找到有效和持久的治療方法。

生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的高效載體利用胚胎干細(xì)胞作載體使外源基因的整合篩選等工作能在細(xì)胞水平上進(jìn)行,使操作簡便可靠。

5問題與展望

近年來,隨著生物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)及分子生物學(xué)的發(fā)展,干細(xì)胞研究領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展,某些方面已有初步的臨床應(yīng)用。但是目前干細(xì)胞的研究尚處于初期階段，許多理論問題亟待解決：干細(xì)胞的許多機(jī)制還沒完全清楚，比如在干細(xì)胞可塑性機(jī)理的研究上還存在著分歧。如何使干細(xì)胞在體外大量擴(kuò)增,并誘導(dǎo)其分化是干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)臨床上應(yīng)用的關(guān)鍵。干細(xì)胞如何到達(dá)不同的靶目標(biāo)，并分化為正確的細(xì)胞類型及正確的細(xì)胞數(shù)量、比例以及在正確的位置與正確的靶組織建立正確的聯(lián)系而無任何錯(cuò)誤連接等。干細(xì)胞移植的安全性問題:胚胎干細(xì)胞移植時(shí)會(huì)發(fā)生不適宜的分化,產(chǎn)生免疫排斥作用，但成體干細(xì)胞則沒有這個(gè)問題，其主要的機(jī)理還沒完全明白，因此干細(xì)胞在臨床應(yīng)用前需要進(jìn)行全面的評估。

相信隨著細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,不久的將來干細(xì)胞許多相關(guān)機(jī)制將被逐漸闡明，人類將有可能人為地控制影響干細(xì)胞分化的各項(xiàng)因素，但我們也應(yīng)該清楚的認(rèn)識到，仍有許多懸而未決的問題，干細(xì)胞的臨床應(yīng)用還有很長的路要走。干細(xì)胞用于治療許多疑難癥狀在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)取得了可喜的成就，如果經(jīng)人體臨床試驗(yàn)成功，其潛在的效益將溢現(xiàn)出來，造福人類。

目前，我國在干細(xì)胞研究上相對落后，國家已經(jīng)重視干細(xì)胞的研究，將干細(xì)胞的研究列入973項(xiàng)目，并成立了干細(xì)胞研究所，加強(qiáng)干細(xì)胞的基礎(chǔ)知識與臨床應(yīng)用方面的研究，這將使我國在此領(lǐng)域的理論和實(shí)踐應(yīng)用上得到更大的發(fā)展，在世界上占有一席之地。

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