免疫學(xué)檢測(cè)方法

關(guān)于免疫學(xué)檢測(cè)方法第1頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第2頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第3頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三檢測(cè)技術(shù)種類

一、免疫學(xué)檢測(cè)免疫凝集試驗(yàn)免疫沉淀試驗(yàn)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)熒光免疫技術(shù)免疫電鏡技術(shù)免疫印跡試驗(yàn)第4頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第5頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)菌凝集反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌學(xué)的診斷。在凝集反應(yīng)中，將參與反應(yīng)的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。

凝集法測(cè)定哈維氏弧菌抗體的效價(jià)

管號(hào)1234567磷酸鹽緩沖液0.90.90.90.90.90.91.0兔抗X菌血清0.10.1(1)0.1(2)0.1(3)0.1(4)0.1(5)0.01.稀釋抗體2.玻片凝集法用1ml移液槍取6號(hào)離心管中的溶液一滴滴在載玻片的一端，另一端加一滴磷酸鹽緩沖液，然后分別加一滴準(zhǔn)備好的X菌液。牙簽混勻，至于顯微鏡下觀察，看是否有凝集塊的形成。后取5、4……1號(hào)管的溶液逐個(gè)重復(fù)1、2步驟。取有凝集塊變?yōu)闊o(wú)凝集塊時(shí),那個(gè)有凝集反應(yīng)的試管作為抗體的效價(jià)。第6頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第7頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第8頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第9頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三沉淀凝集反應(yīng)第10頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第11頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第12頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第13頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第14頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三雙向免疫擴(kuò)散沉淀線示意圖第15頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三瓊擴(kuò)反應(yīng)第16頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第17頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第18頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三中和實(shí)驗(yàn)第19頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三熒光免疫技術(shù)

熒光免疫技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)。它將免疫化學(xué)和血清學(xué)的高度特異性和敏感性與顯微技術(shù)的高度精確性相結(jié)合，為免疫學(xué)、臨床組織化學(xué)及實(shí)驗(yàn)室診斷提供了一項(xiàng)其它方法尚不能取代的、并有其獨(dú)特風(fēng)格的技術(shù)。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)以及真菌等的鑒定和相應(yīng)病的診斷，血清抗體的檢查，病理組織學(xué)抗原、抗體和補(bǔ)體的鑒定及定位，免疫復(fù)合物病理的研究，細(xì)菌、病毒與細(xì)胞之間抗原關(guān)系的研究等方面。其主要優(yōu)點(diǎn)在于：特異性強(qiáng)，速度快，敏感性高；其缺點(diǎn)在于：非特異性染色問(wèn)題尚未解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也比較復(fù)雜。第20頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、原理

熒光免疫技術(shù)是一種以熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物的免疫分析技術(shù)，熒光物質(zhì)的分子在特定條件下吸收激發(fā)光的能量后，分子呈激發(fā)態(tài)而極不穩(wěn)定，其迅速回到基態(tài)時(shí)，以電磁輻射形式釋放出所有的光能，發(fā)射出波長(zhǎng)較照射光長(zhǎng)的熒光。熒光免疫技術(shù)可分為熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)和熒光測(cè)定技術(shù)。熒光抗體技術(shù)屬于前者，它是利用某些熒光素通過(guò)化學(xué)方法與特異性抗體結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物在一定波長(zhǎng)光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此借助熒光顯微鏡檢測(cè)或定位被檢抗原。其又可分為直接熒光抗體法、間接熒光抗體法和補(bǔ)體熒光抗體法。第21頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三熒光色素異硫氰酸熒光素（FITC）四乙基羅丹明（RB200）四甲基異硫氰酸羅丹明（TMRITC)第22頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、熒光抗體染色方法

直接法間接法

2、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用

在細(xì)菌學(xué)診斷中的應(yīng)用

在病毒感染診斷中的應(yīng)用

其它方面的應(yīng)用第23頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三間接熒光抗體法（IFAT）操作步驟如下：

（1）單層血細(xì)胞滴片，室溫晾干，放入丙酮中固定10min。室溫晾干。

（2）以小白鼠抗血清（或雜交瘤細(xì)胞上清液）為第一抗體，加在血細(xì)胞抗原上。37℃濕盒中孵育45min。

（3）0.01MPBS洗三次，每次5min。

（4）加第二抗體IgG-FITC，37℃濕盒中孵育45min。

（5）0.01MPBS洗三次，每次5min。

（6）甘油封片，熒光鏡下觀察，拍照。第24頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三間接免疫熒光法檢測(cè)對(duì)蝦白斑癥病毒病第25頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三間接免疫熒光法檢測(cè)淋巴囊腫病毒第26頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第27頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第28頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第29頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三直接ELISA第30頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三間接ELISA第31頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作步驟如下：（1）分別以不同單抗為第一抗體，加在血細(xì)胞抗原上。37℃濕盒中孵育60min。（2）0.01MPBS洗三次，每次5min。（3）加AP-IgG為第二抗體，37℃濕盒中孵育45min。（4）0.01MPBS洗三次，每次5min。（5）加NBT/BCIP底物緩沖液發(fā)色10min，（6）出現(xiàn)顏色加終止液終止反應(yīng)。

（7）用酶標(biāo)分析儀在405nm,處測(cè)定各孔的吸光度，計(jì)算P／N（樣品光吸收值與陰性對(duì)照的值），判定ELISA反應(yīng)結(jié)果。大于2.1時(shí)可判斷為陽(yáng)性。以最大顯色至陽(yáng)性的顯色孔50%反應(yīng)孔的抗體稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。

第32頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第33頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三圖

DOTBLOT方法篩選結(jié)果圖。第34頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三免疫組織化學(xué)方法定扇貝血細(xì)胞分布第35頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)病毒感染第36頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三四、Westernblot

是蛋白水平檢測(cè)，研究基因表達(dá)與功能的一種方法。原理及步驟樣品

聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白（SDS)

轉(zhuǎn)移（印跡）于硝酸纖維素膜

加抗體檢測(cè)某種特異性蛋白質(zhì)第37頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三WestBlot第38頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三圖：淋巴囊腫病毒與抗血清的Westernblotting結(jié)果第39頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第40頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)（immuneelectronmicroscopictechnique）是一種將免疫學(xué)技術(shù)與電子顯微鏡技術(shù)相結(jié)合的血清學(xué)方法，能使抗原在分子水平上進(jìn)行定位。它實(shí)際上是將細(xì)胞水平的熒光抗體技術(shù)的基本原理應(yīng)用于分子水平上。這一技術(shù)的發(fā)明使抗原和抗體的定位研究達(dá)到了亞細(xì)胞或分子水平。主要有以下幾種技術(shù)。鐵蛋白抗體法酶標(biāo)記抗體法重金屬標(biāo)記抗體法第41頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三圖膠體金標(biāo)記免疫電鏡結(jié)果[(A)(D)bar=200nm;(B)(C)bar=100nm]第42頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三膠體金免疫技術(shù)膠體金是氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸等作用下的水溶液，具有高電子密度，并能與多種大分子發(fā)生物理吸附，因此，不但所有的大分子物質(zhì)都可被金標(biāo)記，而且標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。當(dāng)抗原和金標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑條（點(diǎn)）,在顯微鏡下觀察，抗原抗體結(jié)合處為黑褐色的顆粒。第43頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三

斑點(diǎn)免疫金滲濾法（DIGFA）的應(yīng)用與研究進(jìn)展是20世紀(jì)八十年代發(fā)展起來(lái)的一種免疫學(xué)檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。目前在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中主要應(yīng)用于檢測(cè)HBsAg、HCG和HIV等。第44頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三斑點(diǎn)免疫金滲濾法原理：

NCM為固相載體通過(guò)滲濾抗原與抗體在膜上快速反應(yīng)標(biāo)記的膠體金堆積顯色。膠體金抗體抗原NCM吸水墊第45頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三

臨床應(yīng)用：間接法測(cè)抗體：

NCM抗原樣品抗體金標(biāo)抗抗體顯色夾心法測(cè)抗原：

NCM多抗樣品抗原金標(biāo)單抗顯色。第46頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三

直接法檢測(cè)抗原

NCM病毒金標(biāo)單抗顯色

DIGFA步驟簡(jiǎn)化、時(shí)間縮短。

第47頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三DIGFA檢測(cè)操作程序2μl檢測(cè)樣品NCM直徑2mm點(diǎn)晾干；

100μl封閉液，滲入；

100μl的金標(biāo)抗體，滲入；100μl的0.01MPBS-T（含0.05%Tween-20），滲入；檢測(cè)結(jié)果：紅色斑點(diǎn)的為陽(yáng)性，無(wú)紅色斑點(diǎn)的為陰性。陽(yáng)性代表檢測(cè)樣品中有病毒，陰性則無(wú)。第48頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三DIGFA檢測(cè)結(jié)果,紅色斑點(diǎn)的為病毒陽(yáng)性,無(wú)紅色斑點(diǎn)的為病毒陰性。TheresultofDIGFA,reddotshowsthereisWSSV,otherwise,thereisnoWSSV.

第49頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三

免疫金標(biāo)層析法的應(yīng)用與研究進(jìn)展

免疫金層析法快速診斷試紙條是20世紀(jì)90年代以來(lái)在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型體外診斷技術(shù)

醫(yī)學(xué)：乙肝表面抗原、心肌肌鈣蛋白T、

HCG

獸醫(yī)：豬瘟抗體

食品：克倫特羅（瘦肉精）、氯霉素

其他：飼料中的磺胺類藥物殘留物、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品

第50頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三檢測(cè)試紙的原理是：采用夾心免疫層析原理，即由金標(biāo)單抗同檢測(cè)樣品液中的抗原反應(yīng)，形成由金標(biāo)單抗-抗原復(fù)合物，當(dāng)該復(fù)合物層析至硝酸纖維素膜上預(yù)先包被在檢測(cè)線上的另一種單抗處時(shí)，此處的抗體會(huì)識(shí)別該復(fù)合物中抗原，反應(yīng)的結(jié)果便形成了金標(biāo)單抗+抗原+包被單抗的夾心結(jié)構(gòu)，最終是金標(biāo)單抗上的膠體金顆粒在此固定并累積出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紅色線，未反應(yīng)的金標(biāo)單抗則仍繼續(xù)層析前行,當(dāng)?shù)竭_(dá)點(diǎn)預(yù)先包被在質(zhì)控線羊抗鼠抗體處時(shí)，金標(biāo)單抗被其結(jié)合住，從而在此處也出現(xiàn)由膠體金顆粒固定并累積而顯現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的紅色線，結(jié)果是：檢測(cè)線顯示紅色表示樣品陽(yáng)性；檢測(cè)線不顯示紅色，表示樣品陰性。質(zhì)控線顯示紅色，表示試紙有效；質(zhì)控線處不顯示紅色，說(shuō)明試紙失效，即或是金標(biāo)單抗、或是羊抗鼠抗體失活，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。第51頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三該試紙條構(gòu)成:載體板7；在該載體板7的兩端部，分別設(shè)有加樣端4吸水層和手持端1吸水層；在該載體板7中部段設(shè)有硝酸纖維膜的檢測(cè)層2，在該檢測(cè)層2與加樣端4吸水層交界處，設(shè)有載有金標(biāo)單抗E的玻璃纖維層塊3，該層塊3一端部分設(shè)置在加樣端4吸水層之下，其另一端部分設(shè)置在檢測(cè)層2之上；在與該層塊3延續(xù)的檢測(cè)層2上設(shè)有檢測(cè)線6和質(zhì)控線5，該檢測(cè)線6和質(zhì)控線5處分別包被有抗病毒單抗和羊抗鼠IgG。第52頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三

用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。

直接化學(xué)發(fā)光免疫分析第53頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三發(fā)光YYY磁微粒被測(cè)抗原+抗體+帶丫啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后

夾心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理第54頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三磁微粒模式圖YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點(diǎn)已結(jié)合的抗原和抗體與未結(jié)合部分的易分離磁微粒技術(shù)第55頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三五、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）

PCR是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。體外程序化的DNA合成技術(shù)。KaryB.Mullis第56頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三第57頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三PCR第58頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAAStep3:Extension延伸72°CCGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA第59頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三原理：1)合成待擴(kuò)增區(qū)域兩端已知序列，與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸特異性引物，引物的序列決定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度；2)反應(yīng)體系：DNA模板，dNTP，TaqDNA聚合酶，buffer3)反應(yīng)程序：

變性(94~95oC)

復(fù)性

延伸

(37~55oC)(70~72oC)72oC延伸10min30-35cycles

DNA擴(kuò)增100萬(wàn)倍第60頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三PCR擴(kuò)增第61頁(yè)，講稿共68頁(yè)，2023年5月2日，星期三PCR特點(diǎn)及應(yīng)用：優(yōu)點(diǎn)：（1）特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定可靠、快速；（2）微量的