細(xì)胞工程研究常用設(shè)備和技術(shù)

細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室它必須滿足三個(gè)基本的需要，即：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，包括培養(yǎng)基配制，洗滌與滅菌等；無菌操作；控制培養(yǎng)。第一節(jié)、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)1本文檔共52頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分2本文檔共52頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分3本文檔共52頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分一、基本實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備室：準(zhǔn)備室的功能就是進(jìn)行一切與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的準(zhǔn)備工作。要求寬敞明亮，通風(fēng)條件好。接種室：接種室的功能是進(jìn)行無菌操作。要求封閉性好，干燥清潔，能較長時(shí)間保持無菌。房間一般不宜過大，其規(guī)模根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而定。接種室除了出入口和通氣口外，其余應(yīng)密閉。培養(yǎng)室：培養(yǎng)室的功能是對離體材料進(jìn)行控制培養(yǎng)。其首要要求是要能控制光照和溫度，其次為防止微生物感染，培養(yǎng)室應(yīng)保持干燥和清潔。4本文檔共52頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分5本文檔共52頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分6本文檔共52頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分基本實(shí)驗(yàn)室-培養(yǎng)室7本文檔共52頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分二、輔助實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室：其功能是對培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。攝影室及暗室：其功能是進(jìn)行培養(yǎng)材料的攝影記錄和膠片沖印。在有條件的情況下可建立此實(shí)驗(yàn)室。生化分析室：在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實(shí)驗(yàn)室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室布局的其基本要求是：便于隔離、便于操作、便于滅菌、便于觀察。8本文檔共52頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分第二節(jié)實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備一、水純化裝置用于細(xì)胞工程的培養(yǎng)基和其他溶液一般都要用雙蒸水或三次蒸餾水來配置。實(shí)驗(yàn)室常用的純水裝置：不銹鋼蒸餾水器、石英自動(dòng)純水蒸餾器、超純水裝置。9本文檔共52頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分不銹鋼蒸餾水器10本文檔共52頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分11本文檔共52頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分主要由多個(gè)過濾部件組成。水先經(jīng)過預(yù)過濾層除去粗雜質(zhì)，然后經(jīng)過有機(jī)層、去離子層、去熱原層，再經(jīng)過0.22微米濾膜過濾除菌，得到超純水。超純水裝置12本文檔共52頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分二、超聲波清洗器超聲波清洗功能主要是利用超聲波在液體中的“空化”作用，使黏附在物體表面的各類污物剝落，同時(shí)超聲波在液體中又能加速溶解作用和乳化作用，再加上合適的清洗劑配合，就可以達(dá)到清洗目的。超聲波清洗效果好、速度快，尤其對于采用一般常規(guī)清洗方法難于達(dá)到清潔度要求，以及手工清洗解決不了的縫隙、小孔、內(nèi)腔等。13本文檔共52頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分14本文檔共52頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分三、蒸汽壓力消毒器實(shí)驗(yàn)室中最常用的滅菌設(shè)備就是高壓蒸汽滅菌器。常見的有立式、臥式和手提式幾種?；静僮鞑襟E：向鍋內(nèi)注水到規(guī)定刻度，注意保持導(dǎo)氣管通暢；將待滅菌物放入鍋內(nèi)，蓋緊鍋蓋；通電加熱，排放冷氣；加熱至壓力額定值，開始計(jì)時(shí)；計(jì)時(shí)結(jié)束，切斷電源，自然降壓至接近零；滅菌器蓋微開5min，取出滅菌物；15本文檔共52頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分16本文檔共52頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分17本文檔共52頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分18本文檔共52頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分19本文檔共52頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分四、干熱滅菌干燥箱用于器械和玻璃器皿的干熱滅菌或烘干。使用方法如下：將待滅菌物放入箱內(nèi)，注意不要放得太擠，以利空氣流通；關(guān)箱門，接通電源，打開開關(guān)，旋動(dòng)恒溫調(diào)節(jié)器至指定溫度。若需鼓風(fēng)，則應(yīng)與升溫同時(shí)開始，不能先升溫后鼓風(fēng)，以免導(dǎo)致起火或玻璃器皿破裂；溫度上升至指定溫度后，維持所需的時(shí)間；滅菌或烘干完畢后切斷電源，待溫度降至70℃以下時(shí)，可開箱取物；20本文檔共52頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分五、過濾除菌裝置1.蔡氏濾器使用混合纖維素酯微孔濾膜，孔徑有0.22微米、0.45微米等不同規(guī)格。蔡氏濾器可分為抽濾式（負(fù)壓，抽真空）和加壓式（正壓，氮?dú)饧訅海﹥煞N。2.針頭式濾器針頭式加壓塑料小濾器的上下部件為螺旋式連接，中間夾一層微孔濾膜（常用孔徑為0.22微米），濾器上部的進(jìn)液口可直接接在注射器上，液體經(jīng)注射器加壓進(jìn)入濾器，經(jīng)過膜過濾除菌后，由濾器下部的出液口流出。21本文檔共52頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分22本文檔共52頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分六、超凈工作臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。23本文檔共52頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分超凈工作臺是以空氣過濾去除雜菌孢子和灰塵顆粒來達(dá)到空氣凈化目的的裝置，主要由鼓風(fēng)機(jī)、濾板、操作臺和照明燈組成。單人和雙人，垂直和平流；75%酒精擦拭超凈臺，放入器械，開紫外燈30min，關(guān)閉紫外燈，點(diǎn)燃酒精燈在下火焰方進(jìn)行操作。24本文檔共52頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分25本文檔共52頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分生物安全柜是為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標(biāo)本等具有感染性的實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，用來保護(hù)操作者本人、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設(shè)計(jì)的。

七、生物安全柜26本文檔共52頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分根據(jù)生物安全防護(hù)水平的差異，生物安全柜可分為一級、二級和三級三種類型。一級生物安全柜可保護(hù)工作人員和環(huán)境而不保護(hù)樣品。二級生物安全柜是目前應(yīng)用最為廣泛的柜型。二級生物安全柜依照入口氣流風(fēng)速、排氣方式和循環(huán)方式可分為4個(gè)級別：A1型，A2型，B1型和B2型。所有的二級生物安全柜都可提供工作人員、環(huán)境和產(chǎn)品的保護(hù)。三級生物安全柜是為生物安全防護(hù)等級為4級實(shí)驗(yàn)室而設(shè)計(jì)的，柜體完全氣密，工作人員通過連接在柜體的手套進(jìn)行操作，俗稱手套箱(Golvebox)，試驗(yàn)品通過雙門的傳遞箱進(jìn)出安全柜以確保不受污染，適用于高風(fēng)險(xiǎn)的生物試驗(yàn)，如進(jìn)行SARS、埃博拉病毒實(shí)驗(yàn)等。27本文檔共52頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分傳染病的傳染性和危害性并不相同，傳染病原分為四個(gè)危害等級。第一級危害群微生物：與人類成人健康和疾病無關(guān)；第二級危害群微生物：引發(fā)人類患病，但很少出現(xiàn)嚴(yán)重情況，通常有預(yù)防及治療方法；第三級危害群微生物：引發(fā)人類患病，并出現(xiàn)嚴(yán)重或致死情況，但可能有預(yù)防和治療方法；第四級危害群微生物：引發(fā)人類患病，并出現(xiàn)嚴(yán)重或致死情況，但通常無預(yù)防與治療方法，諸如炭疽桿菌、霍亂弧菌、埃博拉病毒、天花病毒等。28本文檔共52頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分29本文檔共52頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分30本文檔共52頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分31本文檔共52頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分八、培養(yǎng)箱細(xì)胞在離體培養(yǎng)時(shí)，都需要一定的溫度，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的要求較高，在多數(shù)情況下溫度變化不能超過±0.5℃。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱包括能控制和調(diào)節(jié)溫度的一般培養(yǎng)箱為增加了濕度和CO2調(diào)節(jié)的二氧化碳培養(yǎng)箱。植物細(xì)胞培養(yǎng)增加了照明條件的光照培養(yǎng)箱、人工氣候箱。32本文檔共52頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分33本文檔共52頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分34本文檔共52頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分35本文檔共52頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分九、顯微鏡體視顯微鏡（解剖鏡）：用于觀察和剝離較小器官和組織，也可用來觀察愈傷組織的生長和發(fā)育。36本文檔共52頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分透射顯微鏡：物鏡在載物臺上方，用于觀察切片、壓片、涂片等。37本文檔共52頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分倒置顯微鏡：物鏡在載物臺下方，可以從培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶或搖瓶的下方觀察培養(yǎng)物，用來實(shí)時(shí)觀察活細(xì)胞的生長情況。38本文檔共52頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分顯微操作系統(tǒng)：用于對細(xì)胞進(jìn)行顯微操作，如細(xì)胞核移植、染色體操作、顯微注射、胚胎切割等工作。39本文檔共52頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分第三節(jié)基本技術(shù)1．洗滌液鉻酸洗滌液是用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)與硫酸(H2SO4)配制而成，可根據(jù)需要配制成弱、中、強(qiáng)三種。一、洗滌技術(shù)40本文檔共52頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分弱用重鉻酸鉀50g加入蒸餾水1L，加熱溶化，冷卻后再緩慢加入濃硫酸90ml。中

用重鉻酸鉀50g加入蒸餾水100ml，加熱溶化，冷卻后再緩慢加入濃硫酸875ml。強(qiáng)

濃硫酸加熱的同時(shí)緩慢加入磨碎的重鉻酸鉀，直到重鉻酸鉀達(dá)到飽和為止。一般濃硫酸1L加入重鉻酸鉀50g。41本文檔共52頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分玻璃器皿洗滌塑料用品洗滌金屬用品洗滌2．洗滌方法不同材料的器械，洗滌方法不同。42本文檔共52頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分玻璃器皿洗滌新的玻璃器皿上附有游離的堿性物質(zhì)，其洗滌方法是用1%的HCl溶液浸泡24h，再用洗滌劑洗刷，然后用清水反復(fù)沖洗，最后用蒸餾水沖洗1～2次，干燥后即可使用。已使用過的試管、燒杯、三角瓶等，先將器皿中的殘?jiān)?，用清水洗凈，再用洗滌劑洗刷，用清水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗1～2次。用過的吸管、滴管等內(nèi)徑狹小的玻璃制品，需先放入鉻酸洗滌液中浸泡兩小時(shí)以上，取出后經(jīng)流水沖洗半小時(shí)左右，再用蒸餾水沖洗1～2次，然后烘干或晾干。43本文檔共52頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分載玻片和蓋玻片容易破碎，洗滌時(shí)不宜用力擦洗，其洗滌方法是先用清水沖洗，然后放入鉻酸洗滌液中浸泡幾小時(shí)或用稀鉻酸洗滌液煮沸半小時(shí)，取出后用清水沖洗干凈，將其儲(chǔ)藏在95%的酒精中。塑料用品洗滌：塑料用品一般用合成洗滌劑洗滌，因其附著力較強(qiáng)，因此沖洗時(shí)必須反復(fù)多次，最后用蒸餾水沖洗。金屬用品洗滌：金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌，需要清洗時(shí)，一般用酒精擦洗，并保持干燥。44本文檔共52頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分二、滅菌和消毒技術(shù)物理方法：干熱、濕熱、射線處理、物理除菌過濾、離心沉淀等；化學(xué)方法：消毒劑、抗菌素滅菌；培養(yǎng)基滅菌、玻璃器皿滅菌、金屬用具滅菌、接種室滅菌、外植體滅菌。45本文檔共52頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分幾種常用消毒劑效果比較46本文檔共52頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分第四節(jié)培養(yǎng)基及其配置用于植物離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基至少包括無機(jī)鹽；有機(jī)化合物；生長調(diào)節(jié)劑三大基本組成以及根據(jù)不同需要的其它附加成分。47本文檔共52頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分一、無機(jī)鹽類必需元素在體內(nèi)的生理作用主要包括四個(gè)方面：組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，如植物激素、酶以及酶的活化劑，參與植物的代謝活動(dòng)；元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等生物電化學(xué)方面的作用；發(fā)育過程中，影響組織器官的建成；48本文檔共52頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分二、有機(jī)化合物糖類既可作為C源，又可維持培養(yǎng)基的滲透壓。植物組織培養(yǎng)中常使用蔗糖，在某些特殊培養(yǎng)類型中，亦使用麥芽糖、葡萄糖、果糖、纖維二糖、甘露糖等。維生素為了使培養(yǎng)物生長得更好，根據(jù)培養(yǎng)目的不同常在培養(yǎng)基中添加一種或多種維生素。常用的維生素包括VB1（鹽酸硫胺素）、VB6（鹽酸吡哆醇）、Vpp(煙酸)、VH(生物素)、VBc（葉酸）、VB5（泛酸鈣）等。49本文檔共52頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分肌醇化學(xué)名稱環(huán)己六醇。肌醇本身并沒有促進(jìn)生長的作用，但它在糖類的相互轉(zhuǎn)化、維生素、激素的利用等方面具有重要的促進(jìn)作用，所以它能使培養(yǎng)物快速生長，對胚狀體和芽的形成有良好的影響。腺嘌呤腺嘌呤是合成各種細(xì)胞分裂素的前體之一，外源添加腺嘌呤有利于細(xì)胞協(xié)調(diào)自身合成細(xì)胞分裂素，有利于細(xì)胞的分裂和分化，促進(jìn)芽的形成和生長。氨基酸氨基酸是蛋白質(zhì)的組成成分。常用的氨基酸為甘氨酸及多種氨基酸的混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。50本文檔共52頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期二\5點(diǎn)23分三、植物激素生長素類常用的生長素有IAA(吲哆乙酸)、NAA(奈乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)和IBA(吲哆丁酸)等。