熒光檢測復(fù)習(xí)題參考答案

熒光檢測復(fù)習(xí)題參考答案(總11頁)--本頁僅作為文檔封面，使用時請直接刪除即可----10熒光檢測在醫(yī)學(xué)試驗中的應(yīng)用–復(fù)習(xí)題第一章總論熒光的發(fā)生及根本檢測原理何謂發(fā)光分子吸取輻射被激發(fā)后以光的形式釋放，輻射躍遷而衰變回到電子基態(tài)→發(fā)光熒光與磷光的區(qū)分熒光：激發(fā)后馬上發(fā)光，第一電子激發(fā)單重態(tài)輻射躍遷；延遲109～107 秒后?；鶓B(tài)S0→單重態(tài)S1、S2躍遷→基態(tài)。磷光：延遲秒或更長103～10秒電子自旋未配對進入受激三重態(tài)，三重態(tài)→躍遷→基態(tài)完成良好熒光檢測的有關(guān)條件1〕2〕選擇足夠強度的激發(fā)光源，熒光強度與入射光強度成正比If＝φfI0(1It/I0)；3〕選擇適宜(QE)的放射波長檢測器件；4〕掌握好樣品制備與檢測環(huán)境體系。熒光的種類依據(jù)激發(fā)方式。1〕2〕3〕生物熒光。1〕2〕3〕誘導(dǎo)熒光有哪幾種熒光現(xiàn)象III發(fā)出很弱的熒光，對此類分子需先經(jīng)熒光色素標(biāo)記結(jié)合或插入到不發(fā)光的大分子中去，依據(jù)熒光探針的熒光分析大分子。影響熒光強度〔If〕的因素1片時應(yīng)避光。2〔1〕溫度淬滅：加快震驚弛豫而喪失振動能量；增加分子熱運動高溫?zé)晒夥肿优c液基環(huán)境中分子碰撞。溫度適宜或低溫?！?〕濃度淬滅：濃度大時發(fā)光分子在樣品中分布不均，深部的分子吸取不到光子，量子產(chǎn)額反而小。生成二聚體或多聚體，轉(zhuǎn)變吸取光譜，If〔3〕雜質(zhì)淬滅：靜態(tài)淬滅，雜質(zhì)與熒光分子組成另一種化合物。環(huán)境凈化。碰撞、轉(zhuǎn)入三重態(tài)淬滅。3pHpH7Tmax1/2λ1λ2)也稱帶寬(Bandwidth),帶寬窄則光色純。其次章熒光成像檢測光學(xué)顯微鏡區(qū)分率定義及簡易計算公式影響光學(xué)顯微鏡區(qū)分率的主要因素影響區(qū)分率的因素為衍射效應(yīng)：圓斑像AIRY斑，阻礙區(qū)分率。聚光鏡與物鏡孔徑光闌的對應(yīng)調(diào)整目的：產(chǎn)生與物鏡相應(yīng)的光束，使鏡像的反差和焦深處于最正確狀NANA調(diào)整。觀看：與物鏡NA全都(100%)，以得到較好的區(qū)分率；照像：NA60~80%,以得到較好的反差、焦深。光學(xué)顯微鏡的有效放大＝所用物鏡NA值的500～1000倍熒光量子效率〔QE〕熒光量子效(產(chǎn))率=放射量子數(shù)／吸取量子數(shù)醫(yī)學(xué)試驗中熒光檢測常用的熒光檢測傳感器是哪兩種1轉(zhuǎn)換光學(xué)信號為電子信號光學(xué)傳感器,2彩色CCD顯微鏡照相術(shù)的定義將顯微鏡視場中的微觀圖像記錄為放大圖像的技術(shù)CCD溫度和靈敏度，CCD工作時，外表會產(chǎn)生熱量，使得在芯片形成暗電流，暗流將增加噪音、降低信噪比、導(dǎo)致降低成像質(zhì)量。CCD顯示或照片倍率＝OBJ倍率×光學(xué)適配器倍率×顯示或照片對角線長度／CCDCCD數(shù)字CCD優(yōu)點：價低，使用簡便，成像塊，測得FI同LSCM，彩色復(fù)原好，圖像近于鏡下，光化淬滅損害小。Ratio測鈣、使用TC板，適于標(biāo)本：薄、層次簡潔。缺點：厚標(biāo)本圖像質(zhì)量差，無光切功能，整合功能配置價格不菲3D觀測，集成熒光分析功能。缺點：本錢高〔專人、耗材〕，光化淬滅損害較大免疫熒光染色的目的將抗體標(biāo)記上熒光素〔如FITC、TRITC〕，與細胞內(nèi)相應(yīng)抗原〔目標(biāo)蛋白〕結(jié)合后，通過觀看、檢測具有特征性的熒光，定性、定位及定量的顯示和檢測細胞內(nèi)目的蛋白免疫熒光染色常用方法直接法、間接法和雙標(biāo)記法影響免疫熒光染色結(jié)果的主要因素有1〕熒光染料標(biāo)記的抗體的濃度，2〕pH3〕溶劑舉例說明自發(fā)熒光主要包括哪些動物中一般為黃素類和卟啉類，植物中為葉綠素簡潔產(chǎn)生自發(fā)熒光。脂褐素的自發(fā)熒光，彈力蛋白和膠原UV激發(fā)下呈黃綠色熒光，培育死細胞很簡潔產(chǎn)生自發(fā)熒光。免疫熒光染色前對細胞接種密度的要求細胞密度：依據(jù)試驗?zāi)康恼{(diào)整細胞接種密度。對細胞個體進展形態(tài)學(xué)觀看以及定位熒光信號：細胞密度稍稀疏。使細胞充分伸展，顯示出其應(yīng)有的形態(tài)和構(gòu)造；但也要留意保證視野內(nèi)有肯定數(shù)目的細胞，以便選取有代表性的細胞采圖，要求細胞所占面積不低于視野20%。定量測定熒光強度〔觀看某種蛋白的表達量〕：細胞密度應(yīng)稍高。用于做大量細胞的統(tǒng)計定量，細胞至少要占到視野面積的80%；這時細胞要布滿視野但相互之間還有空隙，細胞排列均勻，不聚堆擁擠，防止細胞間擠壓變形，影響定量結(jié)果。到達通常所說的亞融合狀態(tài)。熒光顯微鏡觀看免疫熒光染色需要設(shè)置的比照及意義正確設(shè)置比照組〔格外必要〕：1.陽性比照：抗原陽性的樣品與待測樣品同時進展免疫熒光染色，比照樣品呈陽性結(jié)果，用于檢驗免疫熒光染色全過程是否符合要求，包括孵育溫度、時間，一抗、二抗是否有問題，分析可能緣由。假設(shè)陽性比照呈陰性，則說明試驗過程有問題，需要對每個條件加以分析改進。2.陰性比照：抗原陰性的樣品作比照，比照樣品應(yīng)呈陰性結(jié)果。包括空白比照〔PBS代替一抗〕和替代比照〔非免疫血清代替一抗〕，用于排解非特異性染色。假設(shè)陰性比照呈陽性表達，同樣檢測樣品的結(jié)果也是不行信的。3.不染色細胞空白組：不經(jīng)免疫熒光染色，直接上機觀看，用于檢測由于細胞本身或固定造成的細胞自發(fā)熒光。共聚焦掃描顯微鏡〔LCSM〕光學(xué)成像原理檢測針孔和光源針孔始終聚焦于同一點，使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進入檢測針孔 高區(qū)分率的光學(xué)切片共聚焦掃描顯微鏡(LSCM)與傳統(tǒng)熒光顯微鏡比較的優(yōu)點三維重建，4〕客觀記錄熒光信息，5〕同時顯示多種標(biāo)記物定義：熒光漂白恢復(fù)(FRAP)：經(jīng)熒光探針標(biāo)記的細胞的某一區(qū)域一旦被高強度的激光照耀后,熒光物質(zhì)的光化學(xué)構(gòu)造被破壞,熒光強度下降,但此處熒光強度會漸漸恢復(fù),熒光強度和恢復(fù)的快慢和多少,代表四周分子集中的速率,或分子運動速度。定義：熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)：受激態(tài)熒光素將其能量向另一個熒光素傳遞，使后者被激發(fā)，這一過程稱熒光能量共振轉(zhuǎn)移。能量的供給者叫供體熒光素，能量的承受者叫受體熒光素。第三章熒光光度檢測熒光分光光度計的構(gòu)造示意圖光源→激發(fā)單色器→樣品杯→放射單色器→檢測器→電子放大及掌握→顯示微孔板熒光檢測在醫(yī)學(xué)試驗的應(yīng)用1〕利用報告基因檢測目標(biāo)基因的表達：將報告基因引入細胞DNA使之與某一特定分子大事相關(guān)，可以為這一分子大事帶來可測性。通常檢測的分子大事是基因功能，具有可測性的是發(fā)光。目前，市場上有很多發(fā)光報告基因出售。包括：螢火蟲熒光素酶〔fireflyluciferase〕，β－半乳糖苷酶〔B-galactosidase〕等。2〕ATP水平測定：全部活細胞都含有ATP。ATP可以從細胞中提取出來，用螢火蟲熒光素酶檢測。熒光強度與樣品中ATP的含量成比例，相應(yīng)的與提取ATP所用的細胞數(shù)成比例?？梢詸z測樣品中的全部微生物，因而被用于檢測水中的大腸桿菌含量，用于藥品，化裝品，牛奶以及其它食品的微生物掌握，測定土壤和沉積物中的全部活生物含量，評價抗生素對微生物生長的影響，了解不同藥物對哺乳動物細胞的影響等。3〕離子測定：如細胞內(nèi)鈣離子測定?；罴毎麅?nèi)鈣離子濃度測定的方法即從測量出的熒光信號中定量地計算出鈣離子濃度。對于單波長激發(fā)或放射的熒光指示劑，可按下式計算[Ca2+]=Kd(F一Fmin)/(Fmax一F)，Kd：熒光劑與Ca2+形成協(xié)作物的解離常數(shù)，F(xiàn)min和Fmax為最小熒光強度和最大熒光強度。對于雙波長的熒光指示劑，用率Ca2+濃度，用下式計算細胞內(nèi)游離Ca2+濃度，[Ca2+]=Kd(Fd/Fs)(RRmin)/(RmaxR)Kd：熒光劑與Ca2+形成協(xié)作物的解離常數(shù).Fd和Fs分別表示熒光劑沒有結(jié)合Ca2+和被Ca2+飽和時的熒光強度.，R為試驗觀看到的熒光比值.Rmin為細胞內(nèi)熒光劑最小量結(jié)合Ca2+時的熒光比值.，Rmax為胞Ca2+飽和時的熒光比值.fura2Fura2:由紫外激發(fā)的一種率測量指示劑，因有較強的親水性，難以進入細胞，在其負性基團部位結(jié)合上親脂的乙酰羥甲基酯成為Fura-2/AMFura-2/AMFura-2Fura-2Fura-2Ca2+結(jié)合后吸取峰Ca2+濃度時,它的最大吸取峰分別在335nm和363nm處，在作率測量時，常常選用的波長是340nm和380nm；結(jié)合鈣和游離鈣形式Fura2的放射峰都是510nm，其放射光的強度與鈣離子的濃度呈比例關(guān)系第四章熒光細胞激活分選、分析簡述流式細胞儀的工作原理流式細胞儀的工作原理：將待測標(biāo)本制備成單細胞懸液,經(jīng)熒光染色后由氣壓裝置送入流淌室,流淌室由樣品管和鞘液管組成,鞘液管布滿流淌的鞘液,鞘液流與樣品流壓力不等,當(dāng)兩者壓力差到達肯定程度時,鞘液裹挾著樣品流迫使細胞有序地排列成單列,逐個進入激光聚焦區(qū)。經(jīng)激光束激發(fā),產(chǎn)生散射光和熒光信號。通過一些波長選擇通透性濾光片,即可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開來。散射光和熒光信號接收后轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號送計算機處理,可在計算機上直觀地統(tǒng)計染上各種熒光染料的細胞各自的百分率。簡述流式細胞儀的構(gòu)造2〕3〕光學(xué)系4〕5〕細胞分選系統(tǒng)前向角散射定義(FSC，F(xiàn)orwardScatter)前向角散射(FSC，F(xiàn)orwardScatter)：0°散射,與被測細胞的大小和面積有關(guān)，精準說與細胞直徑的平方親熱相關(guān)，通常在FCM應(yīng)用中，選取FSC作閾值，來排解樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避開對被測細胞干擾。側(cè)向角散射定義(SSC，SideScatter)側(cè)向角散射(SSC，SideScatter)：90°散射,對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可供給有關(guān)細胞內(nèi)精細構(gòu)造和顆粒性質(zhì)的信息。5AnnexinV/PI根本原理：細胞凋亡早期轉(zhuǎn)變發(fā)生在細胞膜外表，這些細胞膜外表的轉(zhuǎn)變之一是磷脂酰絲氨酸〔PS〕從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外外表。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。AnnexinV是一種Ca2+依靠的磷脂結(jié)合蛋白,具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性,對PS有高度的親和性。該蛋白可充當(dāng)敏感的探針檢測暴露在細胞膜外表的PS。6PI〔碘化丙啶〕染色時消滅細胞凋亡峰的原理在凋亡細胞內(nèi)，由于細胞核的解聚和凋亡小體的形成，核內(nèi)的總DNA含量下降。由于在凋亡細胞內(nèi)DNA含量下降，在G1峰前消滅G1試述PI〔碘化丙啶〕染色應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞周期的原理DNADNA式細胞術(shù)檢測到的與DNA結(jié)合的PI的熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量的多少。由于細胞周期各時相的DNA含量不同,通常正常細胞的G1／G0期具有二倍體細胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。因此,通過流式細胞術(shù)PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進展檢測時,可以將細胞周期各時相區(qū)分為G1／G0期,S期和G2/M期,并可通過特別軟件計算各時相的百分率。流式細胞儀的細胞分選原理流式細胞儀的分選功能是通過流束形成含有細胞的帶電液滴而實現(xiàn)在這些液滴中。此時,細胞的熒光和散射光信號已被測量,經(jīng)規(guī)律推斷，給流束一個充電脈沖信號,小水滴就全部帶上了正負不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾千伏的偏轉(zhuǎn)板時，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中。與其他分選方法相比流式細胞分選的特點1〕少量細胞分選時，流式細胞分選精度高，速度快。先進的流式分選速度可達25000個細胞/秒以上；一次分別的最大合理量為108次方個細胞。2〕Marker43〕不僅僅限于外表標(biāo)記物，流式細胞儀可以依據(jù)任何能檢測到的散射光〔如細胞體積〕或熒光〔如DNA,RNA或蛋白含量，酶活性，特異抗原〕強度差異來分別細胞。4〕假設(shè)只是間或做幾次細胞分選的話，用流式細胞分選還是比較劃算，只需預(yù)備樣品和抗體，交納肯定的儀器使用費用即可，不需要購置配套的設(shè)備。同型比照同型比照是使用與一抗一樣種屬來源、一樣亞型、一樣劑量和一樣的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消退由于抗體非特異性與細胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色。同型比照是真正意義上的陰性比照，它不但可以用來設(shè)定流式細胞儀的電壓，而且還可以幫助省去昂貴與繁瑣的重組細胞因子競爭封閉步驟可能代表了一群更原始的干細胞,且與干細胞的可塑性相關(guān).LCM激光器1.〕單色性好，易于分別，2〕.方向性好3〕.亮度高，強度，而放射光能通過分光鏡進入后續(xù)的檢測系統(tǒng)。2〕.濾光鏡：能夠選擇出肯定波長范圍