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IP屬地：天津 上傳時間：2023-06-27 格式：DOCX 頁數(shù)：8 大?。?98.45KB 積分：20 舉報 版權(quán)申訴

熒光報告基因試驗一、什么是熒光素酶和雙熒光素酶？〔luciferin〕為底物來檢測螢火蟲熒光素Luciferase〕luciferin氧化luciferin氧化的過程中，會發(fā)誕生物熒光luciferin氧化過程中釋放的生miRNA靶基因驗證及啟動子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控等方向爭論。利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反響的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄/下游，構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的凹凸推斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。雙熒光素酶通常是指螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶。螢火蟲熒光素酶是pyralis〕61kDa；海腎熒光素酶〔RenillaLuciferase〕則是從海腎〔Renillareniformis〕中分別，分子量為36kDa?！惨弧硟煞N酶的區(qū)分？底物和輔因子不同：螢火蟲熒光素酶需要熒光素、氧氣、ATP和鎂離子同時存在才能發(fā)光；而海腎熒光素酶僅需要腔腸素〔coelenterazine〕和氧氣。發(fā)光的顏色不同：螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色，波長550-570nm480nm。正是由于這兩種酶的底物和發(fā)光顏色不同，所以在雙報告試驗中得到廣泛應(yīng)用?！捕碁槭裁闯惺茈p熒光素酶報告系統(tǒng)？單報告基因試驗往往會受到各種試驗條件的影響，而雙報告基因則通過共轉(zhuǎn)染的“比照”作為內(nèi)參為試驗供給一基準線，從而可以在最大程度上減小細胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對試驗的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。一般狀況下，海腎熒光素酶基因作為內(nèi)參使用，將帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞；或是將兩個報告基因構(gòu)建到同一個質(zhì)粒上，分別用不同的啟動子啟動其表達。計算結(jié)果時，將螢火蟲熒光素酶的檢測值比上海腎熒光素酶檢測值〔FireflyLuciferase/RenillaLuciferase〕，這樣就可以削減內(nèi)在變化因素對試驗準確性的影響，相當(dāng)于做了標準化，使測試結(jié)果不受試驗條件變化的干擾?！踩畴p熒光素酶報告基因檢測有哪些常用的載體？兩種熒光素酶分別位于兩個載體上。miRNA的靶基因試驗時，這兩種載體分別為：pMIR-REPORTmiRNAmiRNA功能。該載體包含一個CMV啟動子掌握下的螢火蟲熒光素酶報告基miRNA的結(jié)合靶序列或其他核苷酸序列。假設(shè)熒光素酶活性下降，說明該miRNAmiRNA靶序列的作用方式。為例〕，pRL系列載體可在哺乳動物細胞中組成型地表達海腎熒光素酶。又如，爭論轉(zhuǎn)錄因子和啟動子的試驗時，兩種載體分別為：pGL4.20載體，pGL4.20Luciferase熒光素酶報告基因，無啟動子，用于爭論目的啟動子的功能，在熒光素酶基因的上游包含一個多克熒光素酶活性上升，說明該段啟動子受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。pRL系列載體。兩種熒光素酶位于同一個載體上。這樣偏差更小，到底轉(zhuǎn)染一個質(zhì)粒比轉(zhuǎn)染兩個質(zhì)粒要簡潔，在這方面，依據(jù)檢索到的資料顯示，現(xiàn)在的這類質(zhì)粒比較PromegapmirGLO質(zhì)粒。二、雙熒光素酶報告系統(tǒng)有哪些應(yīng)用？〔一〕驗證microRNA同某基因mRNA靶向互作。mRNA3’UTR序為其靶序列。lncRNA序列插入報告F-Luc3’UTR區(qū)域，檢測螢光素酶活性?！踩场餐ǔ閱幼訁^(qū)域〕過表達是否提高螢光素酶活性?！菜摹场餐ǔ?k左右〕進展分段截短，或luciferase報告載體，檢測其啟動子活性。螢光素酶報告系統(tǒng)分析其相對活性?！擦晨梢苑治鲂盘柾肥欠窦せ?。將該信號通路的下游響應(yīng)原件序列構(gòu)建入element(HRE)luciferase報告載cAMPresponseelement〔CRE〕GPCR的激活與抑制劑篩選。三、試驗步驟〔以驗證GeneA為miRNA的靶基由于例〕主要分為：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞→雙報告基因檢測→統(tǒng)計學(xué)分析。需要的病毒或者質(zhì)粒：ctrlOE可以提前包好病毒〕pMIR-REPORT-miRNpspRL-CMV〔作為內(nèi)參〕

〕siRNA組〕試驗步驟〔以24孔板為例〕24孔板miRNA-Ctrl/miRNA-OE〕〔24Mix逐孔參加以削減誤差〕:25ulopti-MEM+300ngplasmid+10ngpRL-CMV25ulopti-MEM+0.45ullip20236h后換液〔試驗分組可參考以下圖，每個組可以設(shè)置3個重復(fù)孔〕Day4雙報告基因檢測XcoldPBS80-100ullysisbuffer〔buffer用量可以依據(jù)細胞量進展調(diào)整；〔2〕30min；〔3〕4℃，12023rpm10min；luciferase96孔板；〔5〕依次參加50ulFireflyLuciferaseBuffer(FB)或50ulRenillaLuciferase,FBRB441室再參加〕;酶標儀檢測發(fā)光。四、數(shù)據(jù)分析〔以miRNA調(diào)控靶基因的試驗為例〕y/ae的比值(F/R4列10列)；l三個重復(fù)孔的平均值〔5列1；1miRNA-OEF/R三個重列〕average1ratio(相當(dāng)于進展了一個標準化);average2。的值作柱狀圖。五、常見問題分析染量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率、加樣精度、檢測過程等，一旦某個細節(jié)處理不好，都可能導(dǎo)致試驗失敗或結(jié)果的不準確?！惨弧碂晒庵颠^高熒光值過高可通過以下方式嘗試解決：削減質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量；細胞樣品裂解后，離心取上清后可適當(dāng)稀釋后檢測。注：不建議通過削減底物量來降低熒光值，需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實的表達水平，否則會造成檢測結(jié)果消滅大的偏差。〔二〕熒光值過低測過程等這幾方面進展考慮：轉(zhuǎn)染效率低優(yōu)化轉(zhuǎn)染試驗條件；DNADNA質(zhì)量進展鑒定；選擇活性較高，處于指數(shù)分裂期的細胞進展轉(zhuǎn)染。檢測過程操作不標準差；〔細胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等〕都需要調(diào)整到室溫；熒光素酶的半衰期一般約30min，加完底物后可馬上檢測，盡量在30min內(nèi)完成。底物氧化失效底物避光密封保存，螢火蟲熒光素酶底物-20℃保存；海腎熒光素酶底物推舉-80℃保存；反響工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配?！踩硰?fù)孔重復(fù)性差還需設(shè)置3個復(fù)孔。想要得到一個準確的結(jié)果，應(yīng)盡可能減小復(fù)孔之間的差異性：細胞裂解后建議離心取上清，保證樣本的均一性；保證加樣的準確性，移液器需定期校準，確保移液精準；是正常的，一般認為在同一個數(shù)量級的差異是可以承受的。六、熒光素酶報告基因還有哪些其他用法？熒光素酶基因還可以用來標記細胞和活體動物，步驟如下：將熒光素酶基因插到預(yù)期分析的細胞染色體內(nèi)；細胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時,熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達；〔腹腔或靜脈注射〕賜予(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反響才可以發(fā)光，因此只有相關(guān)。熒光素酶報告基因標記活體動物的應(yīng)用領(lǐng)域：腫瘤學(xué)：熒光素酶報告基因活體成像能夠讓爭論人員能夠直接快速的測量各種癌癥模型中長的定量分析，避開宰殺老鼠。干細胞與免疫學(xué)：螢火蟲熒光素酶報告基因做示蹤標記干細胞，將目的可以用活體生物發(fā)光成像技術(shù)示蹤干細胞在體內(nèi)的增殖、分化及遷徙的過程。標記免疫細胞價免疫細胞的免疫特異性、增殖、遷移及功能等。蛋白質(zhì)相互作用：可利用動物體內(nèi)生物發(fā)光成像技術(shù)爭論活體動物體內(nèi)C