第2章工業(yè)微生物的菌種選育

二、發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求1.生產(chǎn)力：能在廉價的培養(yǎng)基上迅速生長，代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量高，其它代謝產(chǎn)物少2.操作性：發(fā)酵條件易控制，菌種改造的可操作性要強（有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單），產(chǎn)品易分離3.穩(wěn)定性：抗雜菌和抗噬菌體能力強，遺傳性狀穩(wěn)定，菌種不易變異退化4.安全性：是非病源菌，不產(chǎn)有害生物活性物質(zhì)或毒素第一節(jié)概述本文檔共58頁；當前第1頁；編輯于星期三\8點11分三、菌種選育的目的1、提高發(fā)酵產(chǎn)量2、改進菌種的性能3、產(chǎn)生新的發(fā)酵產(chǎn)物4、去除多余的組分第一節(jié)概述本文檔共58頁；當前第2頁；編輯于星期三\8點11分（一）菌種選育的理論基礎(chǔ)（二）突變誘發(fā)的過程四、菌種選育的基本理論第一節(jié)概述本文檔共58頁；當前第3頁；編輯于星期三\8點11分（一）菌種選育的理論基礎(chǔ)遺傳和變異

基因突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。本文檔共58頁；當前第4頁；編輯于星期三\8點11分前突變：誘變劑所造成的DNA分子的某一位置的結(jié)構(gòu)改變稱為前突變。影響前突變產(chǎn)生的的因素細胞對誘變劑的透性細胞質(zhì)和酶的影響基因所處的狀態(tài)1、前突變形成（二）突變誘發(fā)的過程本文檔共58頁；當前第5頁；編輯于星期三\8點11分

1）光復活作用

2）切補修復

3）重組修復

4）SOS修復系統(tǒng)（多數(shù)誘變來源于此）

5）DNA多聚酶的校正作用2、DNA損傷的修復（二）突變誘發(fā)的過程本文檔共58頁；當前第6頁；編輯于星期三\8點11分（二）突變誘發(fā)的過程本文檔共58頁；當前第7頁；編輯于星期三\8點11分（二）突變誘發(fā)的過程本文檔共58頁；當前第8頁；編輯于星期三\8點11分SOS修復系統(tǒng)

它允許新生的DNA鏈越過胸腺嘧啶二聚體而生長。其代價是保真度的極大降低，這是一個錯誤潛伏的過程。

（二）突變誘發(fā)的過程本文檔共58頁；當前第9頁；編輯于星期三\8點11分校正差錯：光復活作用、切補修復引起差錯：重組修復、SOS修復系統(tǒng)。3、從前突變到突變（二）突變誘發(fā)的過程本文檔共58頁；當前第10頁；編輯于星期三\8點11分表型遲延：表型的改變落后于基因型的改變分離型遲延(基因雜合)經(jīng)誘變處理后，細胞中的基因處于不純的狀態(tài)，突變型基因由于屬于隱性基因而暫時得不到表達，需經(jīng)過復制、分離，在細胞中處于純的狀態(tài)時，其性狀才得以表達。生理性遲延

新的表型必須等到原有基因的產(chǎn)物稀釋到某一程度后才能表現(xiàn)出來。4、從突變到突變型（二）突變誘發(fā)的過程本文檔共58頁；當前第11頁；編輯于星期三\8點11分從菌種保藏中心購買育種從自然界中篩選誘變雜交育種基因工程育種四、菌種來源第一節(jié)概述本文檔共58頁；當前第12頁；編輯于星期三\8點11分CGMCC中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter）成立于1979年，是以提供專業(yè)技術(shù)服務(wù)為主的公益性機構(gòu)，1995年獲得布達佩斯條約國際保藏中心的資格，是我國唯一同時提供一般菌種資源服務(wù)和專利生物材料保存的國家級保藏中心。中心設(shè)立在中國科學院微生物研究所。

本文檔共58頁；當前第13頁；編輯于星期三\8點11分本文檔共58頁；當前第14頁；編輯于星期三\8點11分一、定義二、方法三、特點及應(yīng)用第二節(jié)自然選育本文檔共58頁；當前第15頁；編輯于星期三\8點11分自然選育：在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工誘變處理，根據(jù)菌種的自發(fā)突變而進行菌種篩選的過程。自發(fā)突變：就是指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變。一、定義多因素低劑量的誘變效應(yīng)互變異構(gòu)效應(yīng)第二節(jié)自然選育本文檔共58頁；當前第16頁；編輯于星期三\8點11分二、菌種自然選育方法單菌落分離法菌種單細胞懸液瓊脂板分離挑取單菌落測定生產(chǎn)能力細菌：轉(zhuǎn)種到新鮮肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)放線菌、霉菌：石英砂震蕩打散孢子，棉花或濾紙過濾第二節(jié)自然選育本文檔共58頁；當前第17頁；編輯于星期三\8點11分三、特點及應(yīng)用簡單易行、自發(fā)突變的效率低。純化菌種，防止菌種衰退、穩(wěn)定產(chǎn)量和提高產(chǎn)量第二節(jié)自然選育本文檔共58頁；當前第18頁；編輯于星期三\8點11分1、目前生產(chǎn)用菌種的特點多為人工誘變而來。代謝調(diào)控系統(tǒng)失控。生活力比野生菌株弱。容易發(fā)生變異。菌種衰退原因的分析本文檔共58頁；當前第19頁；編輯于星期三\8點11分2、菌種遺傳特性的改變1）異核現(xiàn)象--導致菌種這一微生物群體發(fā)生變異2）自發(fā)突變3）回復突變或產(chǎn)生分離子--形成具有不同基因型的個體異核體孢子遺傳特性和生長速度不同菌種遺傳特性發(fā)生改變相鄰菌絲細胞吻合回復突變：突變基因再次發(fā)生突變又恢復原來的基因，這類突變稱為回復突變。本文檔共58頁；當前第20頁；編輯于星期三\8點11分1）一個菌種不是純一的群體。3、菌種生理狀態(tài)的改變2）培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的影響3）某些培養(yǎng)條件下，某些基因所處的狀態(tài)不同，使得菌種的生理狀態(tài)不同。主要是因為培養(yǎng)條件不適當。本文檔共58頁；當前第21頁；編輯于星期三\8點11分一、定義及特點二、誘變劑三、誘變育種的主要環(huán)節(jié)第三節(jié)誘變育種本文檔共58頁；當前第22頁；編輯于星期三\8點11分第三節(jié)誘變育種誘變育種：通過誘變劑處理提高菌種的突變頻率，擴大變異幅度，然后采用簡便、高效的篩選方法，從中選出具有優(yōu)良特性的變異菌株的方法。特點：速度快、收效大、方法簡便，但缺乏定向性。一、定義及特點本文檔共58頁；當前第23頁；編輯于星期三\8點11分第三節(jié)誘變育種物理誘變劑：射線如紫外線、X-射線、γ-射線，快中子；化學誘變劑：氮芥、化學因子如堿基類似物、5-氟尿嘧啶、亞硝酸、亞硝基胍等。生物誘變劑：溶原性噬菌體，人工構(gòu)建的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子二、誘變劑本文檔共58頁；當前第24頁；編輯于星期三\8點11分第三節(jié)誘變育種突變的誘發(fā)↓突變株的篩選↓突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn)本文檔共58頁；當前第25頁；編輯于星期三\8點11分1.出發(fā)菌株的選擇2.誘變處理3.篩選4.突變菌株高產(chǎn)基因的表達第三節(jié)誘變育種三、誘變育種的主要環(huán)節(jié)本文檔共58頁；當前第26頁；編輯于星期三\8點11分選擇純種菌株（排除異核體）優(yōu)良性狀的菌株（產(chǎn)生孢子、生長速度）對誘變劑敏感的菌株同時選擇幾株不同的優(yōu)良菌株1.出發(fā)菌株的選擇本文檔共58頁；當前第27頁；編輯于星期三\8點11分1）選擇原則不穩(wěn)定菌株→溫和的、常用的誘變劑；穩(wěn)定菌株→強烈的、不常用的、誘變譜廣的誘變劑不經(jīng)常使用一種誘變劑，也不宜頻繁更換。注意考慮誘變劑本身的特點。

UV→DNA的嘧啶堿基；亞硝酸→嘌呤堿基2.誘變處理本文檔共58頁；當前第28頁；編輯于星期三\8點11分高劑量：致死率90%-99.9%變異幅度大，但負變株多低劑量：致死率75%-80%負變株少，且突變菌株穩(wěn)定2）誘變劑量的選擇本文檔共58頁；當前第29頁；編輯于星期三\8點11分3.篩選根據(jù)步驟可以分為初篩和復篩初篩菌株的量要大，發(fā)酵和測試的條件都可粗放些，采用一個菌種進一個搖瓶的方法進行初篩復篩對發(fā)酵和測試條件要求應(yīng)逐步提高，復篩一般每個菌株進3~5個搖瓶，如果生產(chǎn)能力繼續(xù)保持優(yōu)異，再重復篩選幾次。初篩和復篩均要有親株作對照比較生產(chǎn)能力是否優(yōu)良。復篩后的優(yōu)良菌株要考查其穩(wěn)定性、菌種特性和最適培養(yǎng)條件本文檔共58頁；當前第30頁；編輯于星期三\8點11分根據(jù)操作方法可分為隨機篩選和理性化篩選

隨機篩選

理性化篩選從產(chǎn)物形成的生理生化途徑著手，進行有的放矢的篩選。如營養(yǎng)缺陷型、抗性突變株等。經(jīng)過誘變處理后，進行平板分離，隨機挑選單菌落，篩選高產(chǎn)菌株本文檔共58頁；當前第31頁；編輯于星期三\8點11分

1）搖瓶篩選法

單菌落→傳種斜面→模擬發(fā)酵瓶→測定發(fā)酵能力

2）瓊脂塊篩選法

打孔取塊→鑒定平板測定發(fā)酵能力→(須經(jīng)搖瓶復篩)隨機篩選本文檔共58頁；當前第32頁；編輯于星期三\8點11分3）篩選自動化和篩選工具微型化本文檔共58頁；當前第33頁；編輯于星期三\8點11分96孔板高通量孵育篩選本文檔共58頁；當前第34頁；編輯于星期三\8點11分營養(yǎng)缺陷型菌株篩選理性化篩選

所謂營養(yǎng)缺陷型菌株是微生物經(jīng)誘變劑處理后產(chǎn)生的一種生化突變體。由于基因突變，它失去了合成某種物質(zhì)（氨基酸、維生素或核苷酸堿基）的能力，在基本培養(yǎng)基上不能生長，大多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株需要補加一定種類的有機物質(zhì)后才能生長。本文檔共58頁；當前第35頁；編輯于星期三\8點11分1）篩選用培養(yǎng)基⑴基本培養(yǎng)基：凡是能滿足某種野生型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)基；常以‘[-]’表示；⑵在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素及含氮堿基之類的天然有機物質(zhì)如蛋白胨、酵母膏等，以滿足該微生物的各種營養(yǎng)缺陷型菌株都能生長繁殖的培養(yǎng)基，稱為完全培養(yǎng)基，常用‘[+]’表示；⑶在基本培養(yǎng)基中只是有針對性地加入某一種或某幾種營養(yǎng)缺陷成分，以滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型生長的培養(yǎng)基，稱為補充培養(yǎng)基，補充培養(yǎng)基可按所加入營養(yǎng)成分相應(yīng)地用‘[A]’、‘[B]’等來表示。本文檔共58頁；當前第36頁；編輯于星期三\8點11分2）營養(yǎng)缺陷型菌株篩選的一般方法

（1）誘變劑處理（2）淘汰野生型菌株①抗生素法②菌絲過濾法（3）檢出營養(yǎng)缺陷型（4）鑒定營養(yǎng)缺陷型本文檔共58頁；當前第37頁；編輯于星期三\8點11分檢出營養(yǎng)缺陷型①夾層培養(yǎng)法

②限量補充培養(yǎng)法

③影印接種法

④

逐個檢出法

本文檔共58頁；當前第38頁；編輯于星期三\8點11分將突變菌株放到完全致死的環(huán)境中，一次性篩出抗性突變株。包括：抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體

①抗生素抗性突變：提高產(chǎn)量；

②抗噬菌體突變：消除噬菌體污染；③條件抗性突變：如溫度，可提高產(chǎn)量；抗性突變株篩選本文檔共58頁；當前第39頁；編輯于星期三\8點11分培養(yǎng)基發(fā)酵條件4.突變菌株高產(chǎn)基因的表達本文檔共58頁；當前第40頁；編輯于星期三\8點11分制備菌懸液細菌要處于對數(shù)生長期，此時，生長狀態(tài)同步，生理活性一致，細胞濃度較高。霉菌、放線菌要用孢子。保證菌懸液均勻用玻璃珠振蕩，使細胞均勻分散。維持一定的細胞濃度真菌和酵母一般是106-107個/毫升，放線菌和細菌是108個/毫升。舉例（紫外線育種）本文檔共58頁；當前第41頁；編輯于星期三\8點11分誘變單細胞懸液放置于培養(yǎng)皿中，放入無菌攪拌子。將培養(yǎng)皿置于磁力攪拌器上，打開磁力攪拌器和培養(yǎng)皿蓋，打開紫外燈，計時。培養(yǎng)達到要求時間后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，在紅外燈下稀釋分離，涂平板，用黑布包扎，在適當溫度下培養(yǎng)。誘變最有效的波長是260nm左右（253－265nm），紫外燈的功率為15W，距離固定在30cm左右。本文檔共58頁；當前第42頁；編輯于星期三\8點11分一、定義和特點二、原理三、常規(guī)的雜交育種：準性生殖方式雜交四、原生質(zhì)體融合技術(shù)第四節(jié)雜交育種技術(shù)本文檔共58頁；當前第43頁；編輯于星期三\8點11分雜交育種一般是指兩個不同基因型的菌株通過接合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離和篩選出具有新性狀的菌株。一、定義和特點定向雜交后對誘變劑敏感—消除誘變效應(yīng)飽和改變產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量操作復雜，技術(shù)要求高，推廣和應(yīng)用受限特點本文檔共58頁；當前第44頁；編輯于星期三\8點11分

將兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組（generecombination）。二、原理1.理論基礎(chǔ)－基因重組2.重組與雜交的關(guān)系重組→分子水平，雜交→細胞水平雜交中必然包含著重組；重組則不限于雜交這一形式。本文檔共58頁；當前第45頁；編輯于星期三\8點11分

(一)遺傳標記

所謂營養(yǎng)缺陷型菌株是微生物經(jīng)誘變劑處理后產(chǎn)生的一種生化突變體。由于基因突變，它失去了合成某種物質(zhì)（氨基酸、維生素或核苷酸堿基）的能力，在基本培養(yǎng)基上不能生長，大多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株需要補加一定種類的有機物質(zhì)后才能生長。

營養(yǎng)標記菌株（營養(yǎng)缺陷型菌株）是最常用的遺傳標記之一。三、常規(guī)的雜交育種本文檔共58頁；當前第46頁；編輯于星期三\8點11分(二)異核體形成本文檔共58頁；當前第47頁；編輯于星期三\8點11分(三)雜合二倍體的形成*提高異核二倍體的培養(yǎng)溫度*用紫外線照射異核體特點：體積、DNA含量明顯大于直接親本；具有較高的酶活性，生長速率和糖的利用率較快。提高異核體形成雜合二倍體的常用方法：本文檔共58頁；當前第48頁；編輯于星期三\8點11分（四）重組1染色體交換發(fā)生在體細胞的有絲分裂過程中。特點：形成的兩個子細胞仍為雙倍體細胞，但基因型不同。2染色體單倍化本文檔共58頁；當前第49頁；編輯于星期三\8點11分基因重組甲

生長快、產(chǎn)量低乙生長慢、產(chǎn)量高生長快、產(chǎn)量高應(yīng)用

本文檔共58頁；當前第50頁；編輯于星期三\8點11分

面包酵母:對麥芽糖及葡萄糖的發(fā)酵力強，產(chǎn)生CO2多，生長快；

酒精酵母:產(chǎn)酒率高而對麥芽糖、葡萄糖的發(fā)酵力弱

雜交:就得到了既能生產(chǎn)酒精，又能將其殘余菌體用作面包廠和家用發(fā)面酵母的優(yōu)良菌種。本文檔共58頁；當前第51頁；編輯于星期三\8點11分四、原生質(zhì)體融合用脫壁酶處理，將微生物細胞壁除去，制成原生質(zhì)體，再用聚乙二醇（PEG）促進原生質(zhì)體融合，從而獲得異核體或重組子，這一技術(shù)叫原生質(zhì)體融合。本文檔共58頁；當前第52頁；編輯于星期三\8點11分（一）原生質(zhì)體融合育種步驟本文檔共58頁；當前第53頁；編輯于星期三\8點11