心肌α肌球蛋白重鏈啟動子驅動的綠色熒光蛋白表達載體的構建及鑒定

心肌α肌球蛋白重鏈啟動子驅動的綠色熒光蛋白表達載體的構建及鑒定

關鍵詞】心作者：潘國棟黃永章，郭凌鄖，唐俊明，孔霞，YANGQinglin，王家寧

肌特異性；肌球蛋白重鏈；啟動子；增強型綠色熒光蛋白；干細胞

[摘要]目的：構建并鑒定心肌α肌球蛋白重鏈啟動子驅動的綠色熒光蛋白表達載體，該基因只在心肌中特異性表達。方法：設計5’和3’分別具有SalI/HindⅢ酶切位點的EGFP引物，聚合酶鏈反應法從pLEGFP質粒中擴增增強型綠色熒光蛋白的cDNA，插入pGEM-TEasy載體表達盒，構建pGEM-EGFP，SalI/HindⅢ雙酶切后回收729kb片斷，插入經相同酶切的含kb心肌特異性α肌球蛋白重鏈啟動子的pNC26質粒，構建pMHC-EGFP。連接產物轉化感受態(tài)DH5α，挑選克隆，PCR擴增鑒定，重組質粒經NotI酶切，回收kbMHC-EGFP表達盒。分離培養(yǎng)小鼠心肌細胞與骨骼肌成肌細胞。MHC-EGFP表達盒通過脂質體法分別轉染心肌與骨骼肌成肌細胞。熒光顯微鏡觀察轉染細胞是否出現(xiàn)綠色熒光，以鑒定MHC-EGFP表達盒是否具有表達特異性。結果：EGFPcDNA正確插入pNC26質粒中αMHC啟動子3’端。成功轉染MHC-EGFP表達盒的心肌細胞出現(xiàn)綠色熒光，而轉染的骨骼肌成肌細胞無熒光出現(xiàn)。結論：MHC-EGFP表達盒具有心肌特異性表達特性，為進一步監(jiān)測干細胞向心肌分化研究奠定基礎。

[關鍵詞]心肌特異性；肌球蛋白重鏈；啟動子；增強型綠色熒光蛋白；干細胞

Abstract:ObjectiveToconstructandidentifythecardiac-myosinheavychainpromoter(MHC)-drivenenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)expressionvector(pMHC-EGFP),whichsolelyexpressesEGFPincardiomyocytes.MethodsEGFPcDNAprimersweresynthesizedwithforwardprimerandreverseprimercontainingSalIandHindⅢ,respectively.EGFPcDNAwasamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR),addedsingledeoxyadenosineat3’ends,andsubclonedintopGEM-TeasyvectortoconstructpGEM-EGFP.Thefragmentof729bpfromSalI/HindⅢ-digestedpGEM-EGFPwassubclonedintopNC26,aplasmidcarriedkbMHCpromoter,toconstructpMHC-EGFP.TheexpressioncassetteofkbMHC-EGFPwasrecoveredwithlowmeltingpointagaroseelectrophoresis.Mousecardiomyocytesandskeletalmusclemyoblastswereisolatedandculturedinvitro.MHC-EGFPexpressioncassettewastransfectedintocardiomyocytesandmyoblasts,respectively.EGFPexpressionwasobservedunderfluorescentmicroscope.ResultsEGFPcDNAwassuccessfullyinsertedintothe3’endsofMHCpromoter.Thegreenfluorescencecouldbeobservedintransfectedcardiomyocytes,butnotintransfectedmyoblasts.ConclusionMHC-EGFPexpressioncassettecanbespecificallyexpressedwithincardiomyocytes,whichprovidesabasistomonitorthedifferentiationofstemcellsintocardiomyocytes.

Keywords:Cardiac-specific;Myosinheavychain;Promoter;Enhancedgreenfluorescentprotein;Stemcells

近年來日益興起的大量干細胞研究證實，胚胎或成體間充質干細胞在一定條件下可以分化為心肌樣細胞，為心臟疾病的治療帶來了希望。然而這些心肌樣分化的干細胞是否具有成年心肌的收縮和傳導功能，目前研究還相當缺乏。這是因為通過免疫組織化學或細胞化學染色判斷干細胞分化，需要先對細胞進行固定處理，不能在活細胞狀態(tài)下觀察干細胞的心肌分化。本研究將心肌特異性α肌球蛋白重鏈啟動子與增強型綠色熒光蛋白連接，構建在心肌中特異表達的報告基因系統(tǒng)，使之用于在活細胞狀態(tài)下觀測判斷干細胞的心肌分化，為深入進行干細胞的心肌分化研究奠定基礎。

1材料與方法

材料限制性內切酶SalI、HindⅢ、NotI以及200bpDNAladder和LambdaDNA/HindⅢmarkers購自華美生物工程公司；Taq聚合酶、T4DNA連接酶、dNTP和dATP購自Promega公司；pfuDNA聚合酶購自NewEnglandBiolabs公司；Lipofectamine2000陽離子脂質體購自Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；新生牛血清購自四季青生物材料有限公司；包含kbMHC啟動子的pNC26質粒由MorehouseSchoolofMedicine提供；包含EGFPcDNA的pLEGFP-C1質粒購自Clontech公司；pGEM-TEasyVector系統(tǒng)購自Promega公司；5’端加有SalI和HindⅢ酶切位點的EGFPcDNAPCR上下游引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

方法

pMHC-EGFP構建策略

EGFPcDNA擴增：以pLEGFP-C1為模版，20mmol/L的上下游引物各5μl，pfuDNA聚合酶1μl，10×buffer5μl，10×dNTP5μl，加雙蒸水至總反應體積50μl。進行聚合酶鏈反應：起始變性94℃5min，然后執(zhí)行94℃30s，60℃30s，72℃90s，30次循環(huán)，最后72℃延伸10min。低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收729bpEGFPcDNA片斷。

“T”連接反應：參照本所已建立的方法[1-2]，將回收純化的729bpPCR產物，加入10×buffer5μl，10×MgCl25μl，2mmol/LdATP2μl，Taq酶2μl，加雙蒸水至總反應體積50μl，72℃孵育30min?；厥占兓印癆”后的EGFPcDNA片斷，加10×T4DNA連接buffer5μl，pGEM-TEasyvectorμl，T4DNA連接酶1μl，加雙蒸水至總反應體積10μl，室溫連接3h。將連接產物轉化DH5α，涂布含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h，藍白篩選，挑選白色單菌落接種于含氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，提取質粒酶切鑒定。重組質粒命名為pGEM-EGFP。

MHC-EGFP構建：將pGEM-EGFP和pNC26分別用SalI/HindⅢ雙酶切，前者回收729bp片斷，后者回收線性化pNC26片斷。兩種片斷充分混勻，在T4DNA連接buffer5μl，T4DNA連接酶1μl，總體積10μl體系中室溫連接4h。連接產物轉化DH5α，涂布含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h，挑選單菌落接種于含氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，提取質粒酶切鑒定。重組質粒命名為pMHC-EGFP，經NotI酶切，低熔點瓊脂糖凝膠電泳，回收kb的MHC-EGFP表達盒。

心肌細胞分離培養(yǎng)：取1d齡新生昆明小鼠10只，無菌條件下取出心臟，PBS漂洗，剪碎，加入%胰酶+%EDTA消化液，37℃水浴消化10min，靜置后棄上清。繼續(xù)消化組織團塊，每次加入消化液3~4ml，37℃水浴消化10min，靜置后收集上清，2倍體積含15%新生牛血清DMEM中止消化，重復3~4次。直至組織團塊基本消失。將收集的消化液2000rpm離心，棄上清，含15%新生牛血清DMEM重新懸浮細胞，以1×107/ml接種于25cm一次性塑料培養(yǎng)瓶，于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)2h，使大多數(shù)心肌成纖維細胞貼壁。轉移尚未貼壁的心肌細胞至另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

骨骼肌成肌細胞培養(yǎng)：參考姚啟盛等方法，取成年昆明小鼠，無菌條件下分離雙下肢肌肉，PBS漂洗，剪碎，加入dispaseu/ml,collagenase1%,mmol/l消化液37℃水浴消化30min，2倍體積含15%新生牛血清DMEM中止消化，以1×107/ml接種于25cm一次性塑料培養(yǎng)瓶，于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。

MHC-EGFP表達盒轉染：上述心肌或骨骼肌成肌細胞接種2d后，進行MHC-EGFP基因轉染。將純化的5μgMHC-EGFP與等體積Lipofectamine2000陽離子脂質體50μl充分混勻，靜置10min后，細胞培養(yǎng)液中加入脂質體DNA混合液，孵育6h后換為普通完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察細胞是否出現(xiàn)綠色熒光。

2結果

EGFPcDNA擴增以pLEGFP-C1為模板，經EGFP上下游引物PCR擴增后，2%瓊脂糖凝膠電泳可見特異性729bp擴增片斷。

“T”連接反應擴增產物EGFPcDNA通過Taq聚合酶加“A”，T4DNA連接酶與pGEM-Teasyvector連接，轉化DH5α感受態(tài)，挑選單菌落擴增，提取質粒后，經SalI和HindⅢ雙酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳可見729bp片斷。

pMHC-EGFP構建pGEM-EGFP和pNC26經SalI/HindⅢ雙酶切，T4DNA連接，轉化DH5α感受態(tài)，挑選單菌落擴增，提取質粒后，經SalI和HindⅢ雙酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳可見729bp片斷。

心肌細胞分離培養(yǎng)細胞接種后，經差速貼壁去除大多數(shù)成纖維細胞，貼壁細胞呈現(xiàn)心肌特有多邊形或桿狀形態(tài)。接種10h后觀察到大部分細胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動。

骨骼肌成肌細胞培養(yǎng)貼壁細胞呈扁平、多突起形態(tài)，胞漿極其豐富，生長迅速,符合成肌細胞特征。

MHC-EGFP表達盒轉染及鑒定心肌細胞經脂質體介導MHC-EGFP表達盒轉染后48h，部分細胞綠色熒光。而基因轉染的骨骼肌成肌細胞始終未觀察到綠色熒光細胞。

3討論

心肌α肌球蛋白是成年心肌特有的結構蛋白，由2條重鏈和2條輕鏈組成。α-MHC啟動子結構于1991年明確。pNC26質粒由pBlueScriptⅡSK+質粒插入kbα-MHC啟動子和kb人生長激素polyA構建而成。緊鄰α-MHC啟動子3’含有SalI和HindⅢ酶切位點。為了使EGFPcDNA定向克隆于α-MHC啟動子3’端的SalI和HindⅢ位點，本研究采用兩端分別帶有SalI和HindⅢ的EGFPcDNA擴增的上、下游引物，將PCR產物擴增后加入單個“dA”，利用TA互補原理，可以方便地將EGFPcDNA插入到pGEM-Teasyvector，避免了PCR產物直接酶切不能被酶切位點識別的缺陷。本研究成功地將EGFPcDNA插入到pNC26質粒的SalI和HindⅢ位點上，將pMHC-EGFP經NotI酶切后釋放出了含α-MHC啟動子、EGFPcDNA和polyA的EGFP表達盒。將該表達盒轉染培養(yǎng)的小鼠心肌細胞后，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光，而骨骼肌成肌細胞未見綠色熒光，說明MHC-EGFP表達盒在心肌細胞中特異性表達。MHC-EGFP心肌特異性表達盒對于監(jiān)測干細胞向心肌分化的研究具有重要意義。Takahashi等證實，轉染MHC-EGFP表達盒的胚胎干細胞在心肌分化早期就可以觀察到綠色熒光，其敏感性和準確性都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的免疫組織化學和細胞化學染色。因為MHC啟動子驅動的EGFPcDNA只有在心肌細胞中才能表達。這一特點可以方便地用來監(jiān)測各種因素誘導的干細胞向心肌細胞的分化，尤其是可以在活細胞狀態(tài)下觀察，使進一步對這些細胞進行功能研究