核酸分子雜交(研究生課程)

內(nèi)容提要第二節(jié)核酸探針（Probe）第三節(jié)雜交類別與應(yīng)用第一節(jié)分子雜交概念與基本原理本文檔共77頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分第一節(jié)分子雜交概念與基本原理

Concept&PrincipleofMolecularHybridization本文檔共77頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分

單鏈的核酸分子在合適的條件下，與具有堿基互補(bǔ)序列的異源核酸形成雙鏈雜交體的過程稱核酸分子雜交（molecularhybridization）一、分子雜交概念本文檔共77頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分變性復(fù)性

DNA-DNA雜交雙鏈分子本文檔共77頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分二、分子雜交基本原理變性復(fù)性本文檔共77頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分DNA加熱變性DNA冷卻復(fù)性DNA/RNA雜交Tm(meltingtemperature)

：DNA從部分變性到完全變性是在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，這一溫度范圍的中點(diǎn)稱為熔點(diǎn)溫度。本文檔共77頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分（一）DNA變性（denaturation）1、DNA變性某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性。本文檔共77頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分2、變性的方法（1）熱變性：溫度升高到90~100℃時(shí)，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。（2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時(shí)，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。（3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛純水等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。本文檔共77頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分3、DNA變性曲線

AT區(qū)先解鏈

GC區(qū)后解鏈

階梯式曲線本文檔共77頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分DNA變性的基本過程本文檔共77頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.34、GC含量與Tm值之間的關(guān)系本文檔共77頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。具有互補(bǔ)序列兩條單鏈都可形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。（二）DNA復(fù)性（renaturation）本文檔共77頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分復(fù)性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對(duì)時(shí)，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對(duì)，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子本文檔共77頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分

三、影響雜交（復(fù)性）的因素1、核酸分子的濃度和長(zhǎng)度

濃度越大，復(fù)性速度越快分子越大，復(fù)性速度越慢單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加雙鏈探針，濃度控制在0.1～0.5μg/ml,濃度過高影響雜交效率本文檔共77頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分2、溫

度

（1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低20～25℃（2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5℃本文檔共77頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分3、離子強(qiáng)度

（1）低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加（2）高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度本文檔共77頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分4、甲酰胺

（1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時(shí)探針與待測(cè)核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測(cè)核酸與探針同源性不高時(shí)，加50%甲酰胺溶液在35～42℃雜交；（2）如待測(cè)核酸序列與探針同源性高時(shí)，則用水溶液在68℃雜交。

本文檔共77頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分5、核酸分子的復(fù)雜性

（1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同序列的總長(zhǎng)度（２）兩個(gè)DNA樣品濃度絕對(duì)一致時(shí)，變性后的相對(duì)雜交率取決于DNA的相對(duì)復(fù)雜性本文檔共77頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分6、非特異性雜交反應(yīng)

（1）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對(duì)探針的非特異性吸附（2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉本文檔共77頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分第二節(jié)核酸探針（Probe）本文檔共77頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分

1、什么是探針(probe)一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。一、探針概念本文檔共77頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分

DNA探針是最常用的核酸探針，長(zhǎng)度在幾百bp以上的雙鏈或單鏈cDNA片段（通常400—500bp）放射性或非放射性標(biāo)記的RNA分子，用于探測(cè)與之互補(bǔ)的DNA或RNA鏈，RNA探針通常通過克隆相應(yīng)DNA在體外轉(zhuǎn)錄合成而制備（通常400—500bp）

RNA探針

寡核苷酸探針一般有17-50個(gè)核苷酸組成，可以是寡聚脫氧核醣核酸、寡聚核糖核酸和肽核酸二、探針種類本文檔共77頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分

理想標(biāo)記物應(yīng)具備的特性高度靈敏性不影響堿基配對(duì)的特異性不影響探針分子的主要理化性質(zhì)對(duì)酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大檢測(cè)方法具有高度靈敏性和高度特異性三、探針標(biāo)記物本文檔共77頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分核素標(biāo)記物：32p、35s、3H非核素標(biāo)記物半抗原：生物素、地高率配體：生物素是親和素的配體熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光，如生物素?；膲A性磷酸酶可使發(fā)光底物發(fā)光。

標(biāo)記物種類本文檔共77頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分四、探針標(biāo)記方法隨機(jī)引物標(biāo)記

DNA缺口平移標(biāo)記全程RNA探針標(biāo)記化學(xué)法全程標(biāo)記

3′末端標(biāo)記

5′末端標(biāo)記

本文檔共77頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分隨機(jī)引物標(biāo)記—最常用DNA模板引物和模板DNA結(jié)合加入klenow片斷、3種dNTP和1種標(biāo)記dNTP引物延伸標(biāo)記的DNA片段未標(biāo)記的DNA模板本文檔共77頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分DNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性5’－3’聚合酶活性）＋3dNTP＋1dNTP#DNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性5’－3’聚合酶活性）模板DNA切開模板DNA形成一到幾個(gè)堿基的缺口摻入標(biāo)記基團(tuán)缺口平移DNA缺口平移標(biāo)記本文檔共77頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分在△處酶切在◆處酶切從T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄從SP6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄全程RNA探針標(biāo)記本文檔共77頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分一、設(shè)計(jì)原理化學(xué)法全程標(biāo)記(生物素或地高辛標(biāo)記)

與地高辛標(biāo)記的探針雜交加入與堿性磷酸酶結(jié)合的抗地高辛抗體加入底物BCIP/NBTCSPD本文檔共77頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分一、設(shè)計(jì)原理末端標(biāo)記3’-末端標(biāo)記5’3’3’5’5’末端突出的DNA5’5’3’3’3’末端標(biāo)記的DNA完整雙鏈DNAKlenowDNA聚合酶32p—dNTP變性32p末端標(biāo)記的單鏈DNA探針本文檔共77頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分一、設(shè)計(jì)原理末端標(biāo)記5’-末端標(biāo)記本文檔共77頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分乙醇沉淀法：無水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白質(zhì)凝膠過濾柱層析法：利用凝膠的分子篩作用，將大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸（<80bp)等物質(zhì)分離，常用凝膠基質(zhì)是SephadexG-50微柱離心法：其原理與上述凝膠過濾柱層析法相同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來純化探針。五、探針的純化本文檔共77頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分第三節(jié)雜交類別與應(yīng)用本文檔共77頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分三種印跡技術(shù)的比較本文檔共77頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分

（一）液相雜交

（二）固相雜交（三）原位雜交（四）基因芯片技術(shù)點(diǎn)雜交/狹縫雜交菌落雜交Northern雜交Southern雜交反點(diǎn)向雜交本文檔共77頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分一、MASA液態(tài)芯片本文檔共77頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分二、雜交的基本分類MASA是一種在懸浮液態(tài)體系中進(jìn)行的生物分子間反應(yīng)，并以100種不同熒光編碼的微球作為探針的一類新型生物芯片技術(shù)。它集合了流式細(xì)胞技術(shù)、數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)、激光技術(shù)及傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體，是一種新型生物分子檢測(cè)技術(shù)。其反應(yīng)體系中可以進(jìn)行大分子蛋白、小分子蛋白、核酸等生物的檢測(cè)。本文檔共77頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分MASA技術(shù)的原理是用不同的熒光顏色對(duì)乳膠顆粒進(jìn)行編碼使之具有檢測(cè)多個(gè)靶分子的能力二、雜交的基本分類本文檔共77頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分

概念：反向點(diǎn)雜交(reversedotblot，RDB)是Saiki等提出的一種斑點(diǎn)雜交技術(shù)，是將探針固定在玻璃芯片或尼龍膜上，用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有目標(biāo)基因的技術(shù)。二、反點(diǎn)向雜交本文檔共77頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分原理與應(yīng)用：RDB是先將待用的探針分別點(diǎn)到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，每個(gè)探針一個(gè)點(diǎn)并編上號(hào)，再將待測(cè)的DNA樣本(一般是經(jīng)PCR特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物，在PCR引物5’端預(yù)先進(jìn)行生物素標(biāo)記，使擴(kuò)增產(chǎn)物相應(yīng)標(biāo)記有生物素)與之雜交；本文檔共77頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分

待檢樣本就會(huì)與具有同源序列的探針結(jié)合，經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的DNA樣本，由于待測(cè)的DNA樣本具有生物素類的標(biāo)記物，結(jié)合了待測(cè)DNA的探針點(diǎn)上就帶有生物素類的標(biāo)記物，再經(jīng)相應(yīng)的顯色反應(yīng)就能顯出雜交信號(hào)。

一次就可以判斷某一基因座位的大部分或全部等位基因，因此利用這樣的工作原理還可以用于基因分型、病原體檢測(cè)、腫瘤研究等。

本文檔共77頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分本文檔共77頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分2.Southernblot3.Northernblot4.點(diǎn)雜交和狹縫雜交5.熒光原位雜交6.基因芯片1.菌落雜交三、固向雜交本文檔共77頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分1.菌落雜交本文檔共77頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③2.Southernblot本文檔共77頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分2.Southernblot本文檔共77頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳分離膜上固定DNA片段在緩沖液中將標(biāo)記的探針加到膜上DNA片段從瓊脂糖凝膠上轉(zhuǎn)印到膜上雜交信號(hào)的檢測(cè)2.Southernblot本文檔共77頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分

1、裂解或破碎細(xì)胞

2、抽取純化基因組DNA3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段待測(cè)核酸樣品的制備本文檔共77頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠，分離小片段用高濃度膠2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子DNA泳動(dòng)慢,小分子DNA泳動(dòng)快，大小相同的分子處于同一條帶3、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記

待測(cè)DNA樣品的電泳分離本文檔共77頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分凝膠中核酸的變性（堿變化）

凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液。

本文檔共77頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分Southern印跡指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程本文檔共77頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性①具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力②不影響與探針的雜交反應(yīng)③與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固④具有良好的機(jī)械性能

非特異吸附少本文檔共77頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分（2）常用的固相支持物

①硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)本底低。缺點(diǎn)是DNA分子結(jié)合不牢固②尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高

③化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能力較上述兩種膜低本文檔共77頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分Southern印跡的常用方法

（1）毛細(xì)管虹吸印跡法利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上本文檔共77頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分（2）電轉(zhuǎn)法

利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。本文檔共77頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分（3）真空轉(zhuǎn)移法

此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。本文檔共77頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分

Southern雜交

1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液

2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測(cè)DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交

3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的DNA

本文檔共77頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分

雜交結(jié)果檢測(cè)1、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：適于非核素標(biāo)記的探針本文檔共77頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1、酶切圖譜分析

2、特定基因定性和定量

3、基因突變分析

4、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分析本文檔共77頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分1、基本原理和基本過程與Southernblot

基本相同2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段4、待測(cè)樣品為總RNA或mRNA3.Northern印跡雜交本文檔共77頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分Northern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)

1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時(shí)，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理3、靶核酸為RNA本文檔共77頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分4.點(diǎn)雜交和狹縫雜交

DNA樣品點(diǎn)到濾膜上1變性2中和3固定DNA4與標(biāo)記探針雜交5洗脫與顯影探針DNA探針標(biāo)記

變性將探針加到固定的DNA上本文檔共77頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分

1、斑點(diǎn)印跡為圓形2、狹縫印跡為線狀3、鑒別DNA、RNA4、簡(jiǎn)單、快速，同一張膜可檢測(cè)多個(gè)樣品5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量本文檔共77頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分1）定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測(cè)物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交。5.原位雜交本文檔共77頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分保持組織細(xì)胞的形態(tài)對(duì)核酸無抽提，修飾與降解作用不改變核酸在組織細(xì)胞內(nèi)的定位不阻礙核酸與探針的雜交過程對(duì)雜交信號(hào)無遮蔽作用理化性質(zhì)穩(wěn)定2）雜交過程（1）組織或細(xì)胞的固定，理想固定液應(yīng)具備：本文檔共77頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分（2）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理去垢劑（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白質(zhì)組織細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體控制消化時(shí)間，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻片上脫落本文檔共77頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分（3）探針的選擇與標(biāo)記以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針探針的長(zhǎng)度一般為50～300bp,有時(shí)達(dá)1.5kb

放射性核素標(biāo)記探針敏感性高，操作簡(jiǎn)便穩(wěn)定檢測(cè)結(jié)果分辨率高，但信號(hào)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)非核素標(biāo)記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易于觀察本文檔共77頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期二\16點(diǎn)27分（4）雜交雜交液體積?。?0～20μlcDNA和RNA探針雜交溫度約為50℃

雜交時(shí)間:DNA探針雜交為2～4h.RNA探針雜交過夜雜交前一般將組織切片