厭氧菌的實(shí)驗(yàn)室檢查

厭氧菌的實(shí)驗(yàn)室檢查2.根據(jù)對(duì)氧的耐受性分類專性厭氧菌微需氧菌厭氧菌絕對(duì)厭氧菌中等厭氧菌耐氧厭氧菌微需氧菌（1）專性厭氧菌

一般以有機(jī)物為終末電子受體，只有在低氧分壓（絕對(duì)無氧環(huán)境）、低氧化還原電勢(shì)（Eh）中才能生長(zhǎng)的細(xì)菌，它包括兩大類：絕對(duì)厭氧菌：（對(duì)氧極端敏感的厭氧菌EosA)只能在0.5%氧分壓下生長(zhǎng)或暴露在空氣中10分鐘左右立即死亡的細(xì)菌，如齒垢密螺旋體（T.denticola)，月形單胞菌（Selenomonas)中等厭氧菌：

指能在2%-8%氧分壓中生長(zhǎng)，或暴露在空氣中60-90分鐘仍能存活的厭氧菌。臨床上多見，如脆弱類桿菌（B.frgilis)、產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens)、普氏消化鏈球菌（P.prevola)以及雙歧桿菌屬中許多種都屬于此類菌。（2）微需氧菌

在含10%左右氧分壓能生存，一般只有在含5%-10%CO2條件中才能生長(zhǎng)的細(xì)菌如彎曲菌屬（Campylobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、丙酸桿菌屬等細(xì)菌多屬于此類細(xì)菌，它包括兩大類：耐氧厭氧菌：10%氧分壓能存活微需氧菌：5-10%CO2中能存活

兼性厭氧菌既能在有氧環(huán)境中又能在無氧環(huán)境中生長(zhǎng)的細(xì)菌，即既能以分子氧作為終末電子受體，又能以有機(jī)物作為終末電子受體；既能通過氧化又能通過酵解途徑獲得能量的細(xì)菌。這類菌嚴(yán)格地說一般不屬于厭氧菌的檢驗(yàn)和研究范圍。3.厭氧機(jī)理（4個(gè)學(xué)說）厭氧菌為什么不能在有氧條件下生長(zhǎng)繁殖？(1)細(xì)胞色素和氧化酶學(xué)說(2)觸酶和過氧化物酶學(xué)說（3）Superoxidedismutase(SOD)學(xué)說（4）分子氧干擾和氧化還原電勢(shì)學(xué)說1)分子氧干擾厭氧菌的繁殖2)分子氧干擾RNA的合成3)一般厭氧菌在-100mv~-250mv才能生長(zhǎng),Eh比游離氧更重要,產(chǎn)氣莢膜梭菌只要低Eh,即使環(huán)境中有少量氧也生長(zhǎng).4.厭氧菌分類的變遷和檢索(一)革蘭氏陰性無芽孢厭氧桿菌①類桿菌屬（Baeteroides)最初分為3大群1.B.fragilisgroupB.animalgroup（動(dòng)物群）B.fragilisgroup（脆弱類桿菌群）2.B.oralisgroupprevotella口腔菌群3.B.melaninogenicusporphyromonas（產(chǎn)黑色素類桿菌）類桿菌屬

新增4個(gè)

菌種纖維類桿菌（B.gracilis)糞類桿菌（B.caccae)屎類桿菌（B.merdae)便類桿菌（B.stercoris)類桿菌屬包括25個(gè)菌種普雷沃氏菌屬包括17個(gè)菌種卟啉單胞菌屬包括9個(gè)菌種新增加來自動(dòng)物口腔4個(gè)菌種（p.cangingiralis)(p.macacae)獼猴卟啉單胞菌(p.macacae)犬齒齦卟啉單胞菌(p.cangingiralis)利氏卟啉單胞菌(P.levii)卡氏卟啉單胞菌（P.cafoniae)梭桿菌屬

Fusobacterium,

新增加3個(gè)新種和

3個(gè)亞種齦溝梭桿菌（F.alocis)溝跡梭桿菌（F.sulci)潰瘍梭桿菌（F.ulcerans)具核梭桿菌文森氏亞種、多形亞種、動(dòng)物亞種（F.nucl.sub.polymorphum多形Sub.vincentii文森氏,Sub.animalis動(dòng)物）②梭桿菌屬③二氧化碳嗜纖維菌屬新增二個(gè)菌種溶血二氧化碳嗜纖維菌（C.heamolytica)顆粒二氧化碳嗜纖維菌屬（C.granuluca)有害月形單胞菌（S.noxia)④月形單胞菌屬新增加七個(gè)菌種佛路格氏月形單胞菌（S.flueggei)致傷月形單胞菌（S.infelix)戴安娜月形單胞菌（S.dianae)阿特米斯月形單胞菌（S.artemidis)嗜酸血月形單胞菌（S.aidaminophila)乳酸月形單胞菌（S.lacticifex)⑤新增加一個(gè)菌屬稱為嗜膽菌屬（Bilophila)包括一個(gè)菌種:沃氏嗜膽菌(B.wadworthia)（二)革蘭氏陽性無芽孢桿菌1.雙歧桿菌

包括31個(gè)菌種24個(gè)亞種共55種新增加7個(gè)菌種高盧氏雙歧桿菌（B.gallicum)雞胚雙歧桿菌（Ｂ.gallinarum)反芻雙歧桿菌（B.ruminantium)波倫亞雙歧桿菌(B.saeculare)瘤胃雙歧桿菌(B.merycium)殊形雙歧桿菌(B.inopinatum)棲牙雙歧桿菌(B.denticolaens)(96年從口腔分離新定菌種)其中兩歧雙歧桿菌有a,b兩個(gè)亞種;嗜熱雙歧桿菌有a,b,c,d4個(gè)亞種;嬰兒雙歧桿菌有a,b兩個(gè)亞種,亞種中還有游離型和乳酸型兩個(gè)亞型;青春雙歧桿菌有a,b,c,d4個(gè)亞種;假長(zhǎng)雙歧桿菌有a,b,c,d4個(gè)亞種.長(zhǎng)雙歧桿菌也有a,b兩個(gè)亞種.2.乳桿菌屬

包括50個(gè)菌種7個(gè)亞種新增加菌種4.齦溝乳桿菌(L.rimae)3.齦乳桿菌(L.wli)5.約漢森乳桿菌(L.johmsonu)6.類植物乳桿菌(L.paraplantarum)2.陰道乳桿菌(L.vaginalis)1.口乳桿菌(L.oris)3.丙酸桿菌屬

包括兩大群共9個(gè)種,其中皮膚群3個(gè)菌種。原蛛網(wǎng)菌屬取消，已歸于丙酸桿菌屬,原丙酸蛛網(wǎng)菌被稱為丙酸丙酸桿菌(P.propionica).4.放線菌屬現(xiàn)包括15個(gè)菌種新增加3個(gè)菌種

3.白納德放線菌(A.bernardiae)(90年以后面部或口腔分離菌種）2.杰稅斯放線菌（A.gerencseriae）1.杰格氏放線菌(A.georgiae)(90年后從面部或口腔分離菌株)5.優(yōu)桿菌屬包括36個(gè)菌種新增加2個(gè)菌種2.小優(yōu)桿菌(E.minutum)1.藏匿優(yōu)桿菌(E.saphenus)（三）革蘭氏陽性無芽孢

厭氧球菌1.消化球菌屬只有黑色消化球菌一個(gè)種2.消化鏈球菌屬包括14個(gè)菌種新增4個(gè)菌種1.產(chǎn)氫消化鏈球菌（P.hydrogenalis)90年從糞便陰道2.淚液消化鏈球菌（P.lacrimalis)92年從眼淚分離3.陰道消化鏈球菌(P.vaginalis)92年從陰道分離4.解乳消化鏈球菌(P.lactolyticus)92年從消化牛乳分離3.鏈球菌屬包括6個(gè)群36個(gè)菌種，其中厭氧鏈球菌群4個(gè)菌種含釀膿、口腔、腸球、產(chǎn)乳酸、厭氧和其它群。其中釀膿鏈球菌群（pygenicstreptococcigroup)5個(gè)種口腔鏈球菌群（Oralstreptococcigroup)9個(gè)菌種腸球菌群(enterococcigroup)10個(gè)種乳酸鏈球菌群（Lacticstreptococcigroup)3個(gè)種厭氧鏈球菌群(Anaerobicstreptococcigroup)4個(gè)種其它鏈球菌群(otherstreptococcigroup)5個(gè)種4.瘤胃球菌屬5.葡萄球菌屬

其中有一個(gè)種即解糖葡萄球菌為厭氧菌種。（四）革蘭陽性芽孢桿菌—

梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium)包括85個(gè)菌種和亞種新增加2個(gè)菌種2.毛狀梭菌（C.piliforme)1.隱藏梭菌(C.celatum)5.正常菌群中的厭氧菌主要菌屬呼吸道口腔腸道尿道陰道皮膚類桿菌屬+++++++0梭桿菌屬+++++++0纖毛菌屬±++±000二氧化碳噬纖維菌屬0+0000榮氏菌屬韋0++0+0雙歧桿菌菌屬0-++000乳桿菌屬0+++±++0丙酸桿菌屬0±+±0++放線菌屬±+++000優(yōu)桿菌屬0+++0±±消化球菌屬00++++0消化鏈球菌屬00++±±0梭菌屬00++0±0鏈球菌屬++++±+±普氏菌屬++++-+0注：0表示無或很少，+表示常有；++表示大量存在；+表示不規(guī)則。二、厭氧培養(yǎng)方法簡(jiǎn)介 一個(gè)成功的厭氧培養(yǎng)不僅分離培養(yǎng)時(shí)保持厭氧，而且在標(biāo)本的采集、輸送、培養(yǎng)基制備及接種等過程盡量要求厭氧操作，任何一個(gè)環(huán)節(jié)失誤，都可能導(dǎo)致厭氧菌培養(yǎng)失敗。(一)主要厭氧培養(yǎng)方法1）物理方法：阻斷空氣法、煮沸法、真空法、置換法、燃燒法、噴射換氣法如轉(zhuǎn)管法。2）化學(xué)方法：焦性沒食子酸法、鐵絲絨法、保險(xiǎn)粉法、厭氧培養(yǎng)器。3）生物方法：耗氧法、燕麥發(fā)芽法4）混合方法：厭氧袋（Gas-kit),厭氧罐（Gas-pak),厭氧手套箱（anaerobicglovebox)厭氧培養(yǎng)皿酶系統(tǒng)（瓊脂內(nèi)）+自動(dòng)厭氧器。還原型5.N2HOˉ(CH2)2NSN(CH3)2還原酶（二）主要反應(yīng)1.CO2和H2的產(chǎn)生

3.Cu+H2SO4CuSO4+H22.O2消耗2H2+O2

鈀2H2ONa(K)BH4+2H2ONaBO2+4H2C6H8O7+3NaHCO3Na3(C6H5O7)+3CO2+3H2O60%硫酸銅溶液,吐溫-802%,加入2NH2SO41000ml4CrSO4+2H2SO4+O22Cr2(SO4)3+3H2O6.指示劑6%GS:0.1NNaOH:0.05%亞甲蘭=2:0.1:0.2(CH3)2NNSN(CH3)2亞甲蘭可擰開的瓶帽三、厭氧菌的鑒定方法簡(jiǎn)介（一）臨床常見疾病與厭氧菌感染（二）厭氧菌檢驗(yàn)1.厭氧菌感染的病源學(xué)特點(diǎn)：1）感染面與臨床各科所在的部位有關(guān)，有的感染率可達(dá)100%，60%以上標(biāo)本為混合感染。2）混合感染現(xiàn)象：a單種使用某種抗生素開始有效，很快無效。b病源涂片常只見腸球菌感染，并多易變性易改性。3）檢出率為57-78%，國(guó)內(nèi)30-67%4）繼發(fā)性和慢性遷延性感染多見。腹部及全身性感染與腸道菌群有關(guān)頭面部多來自口腔與呼吸道2、厭氧菌感染的臨床和

細(xì)菌學(xué)特征1）感染局部病灶大量產(chǎn)氣2）分泌物有惡臭氣味4）粘膜破壞及感染口鼻消化道3）分泌物帶血或呈黑色產(chǎn)熒光5）惡臭、無色或黑色，細(xì)菌染色不均，形態(tài)奇特，多形性，涂片有菌,培養(yǎng)陰性（二）厭氧菌檢驗(yàn)1.標(biāo)本采集一個(gè)成功的厭氧培養(yǎng)總是從采集標(biāo)本開始。原則：一切污染正常菌群的標(biāo)本都不宜做此檢驗(yàn)，如咳痰、齒齦拭子、糞便、排泄尿、洗胃液等。2.標(biāo)本輸送原則：厭氧條件下常溫、混合氣體中輸送，輸送時(shí)保持一定濕度3.分離程序4.厭氧菌鑒定的培養(yǎng)基選擇原則1）根據(jù)病變所在部位選擇培養(yǎng)基種類1.側(cè)膿胸穿刺液（P、F、梭）2.肝膿腸穿刺液鏈類梭2)根據(jù)疾病診斷（病名）選擇選擇性培養(yǎng)基韋榮氏消化鏈脆放如側(cè)腦膿腫3）原則上使用選擇性培養(yǎng)基同時(shí)宜加用非選擇性培養(yǎng)基平板。4）厭氧菌培養(yǎng)的特殊性厭氧培養(yǎng)一定要加用需氧培養(yǎng)作為對(duì)照。5.厭氧菌培養(yǎng)基及其組成1）營(yíng)養(yǎng)豐富的物質(zhì):胰蛋白胨、植胨、水解蛋白、動(dòng)物肽鏈與蛋白、酵母膏（粉）、牛肉膏、BHI、甚至血。2）碳水化合物:各類糖。3）還原性物質(zhì):降低氧化還原電勢(shì)L-鹽酸半胱氨酸、硫乙醇酸鹽等。4）鹽類與緩沖鹽類:PBS、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Zn2+等。5）促生長(zhǎng)物：如氯化血紅素（hemin），維生素K1。6.Finegold氏厭氧菌三級(jí)鑒定法一級(jí)鑒定二級(jí)鑒定三級(jí)鑒定一般是初代培養(yǎng)結(jié)果，耐氧試驗(yàn)選擇性培養(yǎng)基、標(biāo)本來源、菌落和菌細(xì)胞特征報(bào)告。特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果,可有助于初步鑒定，如七葉苷膽汁（BBE）平板上出現(xiàn)黑色帶暈大于1mm菌落，經(jīng)檢為Gˉb，染色不均，菌體可見有空泡者，多形態(tài),可初步定為脆弱類桿菌（B.fragilis)。又如在KV血平板上，菌落深陷生長(zhǎng)可能是解脲類桿菌和纖維類桿菌。一級(jí)鑒定3基因探針初步應(yīng)用

制備菌液點(diǎn)樣（NCP濾膜上）80℃干烤5-10min及變形處理預(yù)雜交液加入雜交液加入顯色劑結(jié)果。我們的經(jīng)驗(yàn)是敏感性為89%，特異性91.7%。對(duì)脆弱類桿菌靈敏度為10pgDNA和104CFu/mL，能準(zhǔn)確確診。1厭氧菌藥敏使用的培養(yǎng)基（1）GAM：胰胨10g眎胨5.0g等（2）W-C：胰酶水解酪蛋白10g，酵母粉5g,葡萄糖1g,氯化納5g，L-半胱氨酸1g，Vk10.5mg，氯化血紅素0.5μg瓊脂15-20gPH7.2藥敏的主要方法1.K-B紙片法2.國(guó)際厭氧菌藥敏標(biāo)準(zhǔn)方法——限量瓊脂稀釋法3.試管稀釋法4.微量稀釋法一、受試菌的準(zhǔn)備二、抗生素的稀釋和準(zhǔn)備三、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備四、抗生素的MIC試驗(yàn)五、結(jié)果觀察厭氧菌的藥敏方法介紹5.每次藥敏試驗(yàn)受試菌中應(yīng)注意加入標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控.①B.fragilis脆弱類桿菌(ATCC25285或NCTC9343)②B.thetaiotaomicron多形類桿菌(ATCC29741)③C.perfringens產(chǎn)氣莢膜梭菌(AATCC13124)④E.lentum遲緩真桿菌(ATCC43055)6.瓊脂稀釋法中質(zhì)控菌株MIC值(g/ml)允許范圍（表1）表1質(zhì)控菌株MIC允許范圍(ug/ml青霉素u/ml) 抗生素*脆弱類桿菌*ATCC25285多形類桿菌*ATCC29741遲緩真桿菌*ATCC43055產(chǎn)氣莢膜梭菌**ATCC13124羧芐青霉素（carbinicillin）

16-64

16-64

8-16

0.25-1頭孢哌硐（cefoperazone）

32-64(128)32-128

32-128

0.125-0.5頭孢氨噻肟（cefotaxime）

8-3216-64

64-256

0.6363-0.25氯霉素(chlorampheninol)2-8

4-16

NO

2-8

氯林可霉素（clindamycin）0.5-0.2

2-8

0.06-0.25

0.031-0.125甲哨唑（metronidazole）

0.25-10.5-2

0.5-2

0.125-0.5青霉素G（penicilling）

16-64(8-32)

16-64(8-32)

NO

0.063-0.25阿莫西林/棒酸（Amoxicillin/Clavulanicacid)

0.25-1

0.5-2

NO

0.25-1 抗生素脆弱類桿菌ATCC25285多形類桿菌ATCC29741遲緩真桿菌ATCC43055產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124氨芐青霉素(Aminopenicillins)

16-64

16-64NO

NO氨芐西林/青霉烷砜(Aminopenicillih/sulbactam)(2:1)

0.5-2.0

5-2.0

2-4

0.25-2吡哌西林（piperacillin）

2-8

8-328-32

2-16吡哌西林/他唑巴坦（piperacillin/Tazobactan）

0.12-4

1.25-41-4

1.25-2替卡西林（Ticarcillin）16-64

16-64

16-64

0.5-1.0替卡西林/棒酸(Ticarcillin/Clavulanicacid)

NO0.5-2

16-64

1-4頭孢美唑（cefmetazole）

16-64

8-32

8-32

2-16頭孢西叮（cefoxitin）

4-16

8-32

4-16

2-8續(xù)表1質(zhì)控菌株MIC充許范圍(μg/ml青霉素u/ml) 抗生素脆弱類桿菌ATCC25285多形類桿菌ATCC29741遲緩真桿菌ATCC43055產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124頭孢替坦（cefotetan）

4-1632-128

32-128

2-4頭孢唑肟（ceftizoxime）NO

4-1616-64

1.0-2.5頭孢曲松（ceftriaxone）

32-128

64-256

NO2-4

頭孢孟多（cefamandole）

32-12832-128

NO

0.025-1亞胺培南(Imipenen)

0.003-0.120.06-0.25

0.25-1.0

0.25-0.5拉氧頭孢(latamoxef)

0.25-1

4-16

64-26560.5-8

美羅培南(melopenen)0.06-0.25

0.125-0.5

0.125-0.5

0.5-1.0續(xù)表1質(zhì)控菌株MIC充許范圍(μg/ml青霉素u/ml)*此表引自美國(guó)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)對(duì)厭氧菌藥敏規(guī)定介紹1996.12**實(shí)用抗菌藥物學(xué)第二版戴自英等主編上?？茖W(xué)出版社，1997二、抗生素的稀釋和準(zhǔn)備1.準(zhǔn)確稱取抗生素(我們一般稱取2.56g,加DW或其它液體4ml)，以對(duì)倍稀釋法稀釋成系列濃度2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5?？股亓康倪x擇可據(jù)上表敏感范圍作中點(diǎn)向上、向下各稀釋5個(gè)濃度。2.用于稀釋抗生素的常用液體的選擇列于表2(其它未標(biāo)明的抗生素均可用無菌水溶解)抗生素名稀釋液配制保存氯霉素用少量無水乙醇溶解后加PH6.0磷酸鹽緩沖液4℃長(zhǎng)期保存紅霉素用少量無水乙醇溶解后加PH6.0磷酸鹽緩沖液-20℃3m,4℃2周林可霉素pH7.8磷酸鹽緩沖液儲(chǔ)存于-70℃冰箱中氯林可霉素pH7.8磷酸鹽緩沖液溶化后立即使用青霉素GpH6.0磷酸鹽緩沖液不再凍存四環(huán)素pH4.5磷酸鹽緩沖液同上甲哨唑無菌蒸餾水微熱或加0.