演示文稿真核基因表達(dá)系統(tǒng)

演示文稿真核基因表達(dá)系統(tǒng)本文檔共96頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分（優(yōu)選）真核基因表達(dá)系統(tǒng)本文檔共96頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分概述(introduction)真核基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)(Featuresofeukaryoticgenestructureandregulation)真核表達(dá)系統(tǒng)(eukaryoticgeneexpressionsystem)

酵母表達(dá)系統(tǒng)(yeastexpressionsystem)

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(mammaliancellexpression)

昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(insectcellexpression)

內(nèi)容本文檔共96頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分第一節(jié)概述一、真核基因組的復(fù)雜性二、原核表達(dá)系統(tǒng)的局限性三、真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢本文檔共96頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分一、真核基因組的復(fù)雜性

1.真核基因組巨大大腸桿菌基因組約4×106bp，哺乳類基因組在109bp數(shù)量級大腸桿菌約有4000個基因，人則約有10萬個基因2.真核生物遺傳信息復(fù)雜

原核生物的基因組基本上是單倍體，而真核基因組是二倍體真核生物主要的遺傳物質(zhì)與組蛋白等構(gòu)成染色質(zhì)，被包裹在核膜內(nèi)，核外還有遺傳成分(如線粒體DNA等)，這就增加了基因表達(dá)調(diào)控的層次和復(fù)雜性。本文檔共96頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

細(xì)菌多數(shù)基因按功能相關(guān)成串排列，組成操縱子，共同開啟或關(guān)閉，轉(zhuǎn)錄出多順反子(polycistron)的mRNA；真核生物則是一個結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，即mRNA是單順反子(monocistron)，基本上沒有操縱子的結(jié)構(gòu)。真核細(xì)胞的許多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亞基構(gòu)成的，這就涉及到多個基因協(xié)調(diào)表達(dá)的問題，真核生物基因協(xié)調(diào)表達(dá)要比原核生物復(fù)雜得多。

3.真核生物基因協(xié)調(diào)表達(dá)本文檔共96頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分4.真核生物基因編碼復(fù)雜原核基因組的大部分序列都為基因編碼，而核酸雜交等實(shí)驗表明：哺乳類基因組中僅約10%的序列為蛋白質(zhì)、rRNA、tRNA等編碼，其余約90%的序列功能至今還不清楚。原核生物的基因為蛋白質(zhì)編碼的序列絕大多數(shù)是連續(xù)的，而真核生物為蛋白質(zhì)編碼的基因絕大多數(shù)是不連續(xù)的，即有外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)，轉(zhuǎn)錄后需經(jīng)剪接(splicing)去除內(nèi)含子，才能翻譯獲得完整的蛋白質(zhì)，這就增加了基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)。原核基因組中除rRNA、tRNA基因有多個拷貝外，重復(fù)序列不多。哺乳動物基因組中則存在大量重復(fù)序列(repetitivesequences)。真核生物mRNA5’有帽狀結(jié)構(gòu)，3’末端有PolyA尾巴

本文檔共96頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分1、沒有轉(zhuǎn)錄后的剪接和加工系統(tǒng)

2、缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)：不能進(jìn)行糖基化、磷酸化、甲基化的修飾，影響某些蛋白的活性。二、原核表達(dá)系統(tǒng)的局限性本文檔共96頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分3、在原核細(xì)胞中表達(dá)的真核蛋白不穩(wěn)定

易被細(xì)菌蛋白酶降解;難實(shí)現(xiàn)真正的分泌出胞，其產(chǎn)量很低;而且容易出現(xiàn)信號肽不被切割，或不在特異位置上切割。表達(dá)產(chǎn)物常以包涵體的形式存在，后期變性、復(fù)性的效率低4、內(nèi)毒素的污染

(contaminationofendotoxin)本文檔共96頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分1.具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng):2.具翻譯后修飾系統(tǒng)3.可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá)三、真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢

(advantagesofeukaryoticexpressionsystem)本文檔共96頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

（一）真核基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)

---多層次、多方面（二）真核基因表達(dá)的調(diào)控模式

第二節(jié)真核基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)

FeaturesofEukaryoticgenestructureandexpression本文檔共96頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分真核基因表達(dá)的調(diào)控模式

(Theregulatingmodelof

eukaryoticgeneexpression)

1、轉(zhuǎn)錄前水平(基因組水平)：genelevel2、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控:transcriptionlevel3、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控:post-transcriptionlevel4、翻譯水平的調(diào)控:translationlevel5、翻譯后修飾:post-translationmodification本文檔共96頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分1、轉(zhuǎn)錄前水平(基因組水平)：genelevel

基因結(jié)構(gòu)的改變、穩(wěn)定持久、不可逆，組蛋白修飾，DNA甲基化等本文檔共96頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分2.轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控順式調(diào)控元件(cis-actingelement)

反式作用因子(trans-actingfactor)本文檔共96頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分（1）順式調(diào)控元件(cis-actingelement)

結(jié)構(gòu)基因周圍能與特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而啟動轉(zhuǎn)錄的DNA序列，主要包括：起正性調(diào)節(jié)作用：啟動子、增強(qiáng)子起負(fù)性調(diào)節(jié)作用：沉寂子，終止子，加尾信號本文檔共96頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

啟動子位于基因5’末端與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的核苷酸序列。作用特點(diǎn)是近距離作用、具有方向性、空間位置較恒定。一般包括核心啟動子元件（corepromoterelements)

：指RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小的DNA序列，決定基因轉(zhuǎn)錄的精確起始位點(diǎn)產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄，包括：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及-30區(qū)的TATA-box上游啟動子元件（upstreampromoterelements)

包括-70到-80bp區(qū)域的CAAT盒及其兩側(cè)的GC盒，協(xié)同決定轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)效率組織特異性元件誘導(dǎo)性啟動子元件本文檔共96頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分真核啟動子結(jié)構(gòu)模式圖核心啟動子元件上游啟動子元件本文檔共96頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中常見的元件元件名稱共同序列結(jié)合的蛋白因子名稱分子量結(jié)合DNA長度TATAboxTATAAAATBP30,000~10bpGCboxGGGCGGSP-1105,000~20bpCAATboxGGCCAATCTCTF/NF160,000~22bpOctamerATTTGCATOct-176,000~20bp

Oct-253,000~23bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000~10bpATFGTGACGTAFT?20bp本文檔共96頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

增強(qiáng)子(enhancer)是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件增強(qiáng)子要有啟動子才能發(fā)揮作用，但增強(qiáng)子對啟動子沒有嚴(yán)格的專一性

無方向性（序列、位置）遠(yuǎn)距離作用（1-4kB）無基因特異性具組織特異性構(gòu)建載體本文檔共96頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分沉寂子（silencer)或衰減子（dehancer)

是一類抑制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子，作用方式與增強(qiáng)子相同轉(zhuǎn)錄終止信號：

控制基因轉(zhuǎn)錄的終止，由polyA上游的10-20bp處的加尾信號（AATAA）和polyA下游的G/T簇構(gòu)成

本文檔共96頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分（2）反式作用因子(trans-actingfactor)

由位于不同或相同染色體上相距較遠(yuǎn)的基因所編碼的蛋白質(zhì)因子，通過與順式調(diào)控元件和RNA聚合酶的相互作用而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性。本文檔共96頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分轉(zhuǎn)錄信號1PTrans-actingfactorTrans-actingfactor(DNA結(jié)合蛋白）Cis-actingfactorAgenemRNAofAProteinABgenemRNAofBProteinBDNA本文檔共96頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分3、轉(zhuǎn)錄后的修飾內(nèi)含子的剪接外顯子的拼接mRNA的加尾和加帽mRNA的穩(wěn)定性本文檔共96頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

4、翻譯水平的調(diào)控主要是microRNA對mRNA、tRNA和rRNA的調(diào)控本文檔共96頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分5、翻譯后的調(diào)控

切除信號肽糖基化乙?；姿峄谆鞍踪|(zhì)的降解本文檔共96頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分第三節(jié)真核表達(dá)系統(tǒng)組成：真核表達(dá)載體受體細(xì)胞本文檔共96頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分真核表達(dá)載體

適用于在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。真核載體根據(jù)受體不同，又可分為幾種：酵母表達(dá)載體哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體本文檔共96頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分受體細(xì)胞據(jù)受體細(xì)胞及表達(dá)載體的不同分為3種：酵母表達(dá)系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)本文檔共96頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分發(fā)酵簡單、快速、便宜真核生物，有翻譯后修飾功能可分泌表達(dá)，簡化了純化工藝受體細(xì)胞安全一、酵母表達(dá)系統(tǒng)本文檔共96頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分（一）酵母載體:

1、概念：

攜帶外源基因在酵母細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增和表達(dá)的載體，包括克隆載體和表達(dá)載體。

2、組成元件：遺傳標(biāo)記調(diào)控序列本文檔共96頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分1）遺傳標(biāo)記：用于重組子的篩選和鑒定

營養(yǎng)標(biāo)記基因：亮氨酸（Leu）

抗生素選擇標(biāo)記基因：Zeocin本文檔共96頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

2）調(diào)控序列ARS：酵母復(fù)制起始區(qū)(點(diǎn))酵母啟動子：常用的有:

PGK(磷酸甘油激酶)

GAP（3-磷酸甘油醛脫氫酶）

ADH1(醇脫氫酶)

SUC(蔗糖酶)

Apase(堿性磷酸酶)

酵母著絲粒區(qū)段(CEN)：增加轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性本文檔共96頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

3、類型(types)酵母克隆載體(yeastclonevector)

：不含酵母啟動子，不能在酵母中表達(dá)外源基因，如YIP、YRP、YEP

酵母表達(dá)載體(yeastexpression

vector)：酵母克隆載體+酵母啟動子,若引入信號肽序列，則成為分泌型載體

酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC)

克隆大片段DNA，2μM質(zhì)粒：酵母核質(zhì)中的小的環(huán)狀DNA，可以獨(dú)立復(fù)制并轉(zhuǎn)錄。本文檔共96頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分（1）酵母克隆載體的構(gòu)建酵母整合型質(zhì)粒(yeastintegratedplasmid.Yip)

細(xì)菌質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標(biāo)記，通過同源重組整合入酵母染色體，轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)化率極低。酵母復(fù)制型質(zhì)粒(Yeastreplicableplasmid,YRp)

細(xì)菌質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標(biāo)記(YIp)+酵母復(fù)制序列(ARS),可自主復(fù)制，但穩(wěn)定性差酵母附加子型質(zhì)粒,YEp：細(xì)菌質(zhì)粒DNA+酵母標(biāo)記基因(YIp)+酵母2μM質(zhì)粒，游離于核外存在并自主復(fù)制本文檔共96頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分酵母復(fù)制序列酵母2μM質(zhì)粒本文檔共96頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分（2）酵母表達(dá)載體特點(diǎn)：含酵母啟動子

穿梭載體(shuttlevector)：既可以攜帶外源基因在原核細(xì)胞中復(fù)制，又可以使其在真核細(xì)胞中表達(dá)的載體。種類：啤酒酵母表達(dá)載體畢赤酵母表達(dá)載體：

分泌型表達(dá)載體非分泌型表達(dá)本文檔共96頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分啤酒酵母表達(dá)載體本文檔共96頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分畢赤酵母表達(dá)載體------整合型本文檔共96頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分(3)酵母人工染色體（yeastartificial

chromosome,YAC)----克隆大片段DNA

由下列元件組成

酵母染色體

2umDNA的復(fù)制起始區(qū)

著絲粒序列（CEN)

四膜蟲端粒DNA(TEL)本文檔共96頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分YAC:利用酵母的著絲粒區(qū)段（CEN）、自動復(fù)制序列（ARS）及四膜蟲端粒DNA(TEL)構(gòu)建的人工染色體結(jié)構(gòu)：左臂：TEL、選擇標(biāo)記、ARS、CEN

右臂：TEL、選擇標(biāo)記特點(diǎn)：容量大（50-1000kb），穩(wěn)定性差作用：構(gòu)建基因組文庫本文檔共96頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分本文檔共96頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

二）受體細(xì)胞

1.啤酒酵母：較早使用，了解清楚安全性高，被FDA確認(rèn)為安全生物表達(dá)量較低過量糖基化轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，易發(fā)生質(zhì)粒丟失本文檔共96頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分2.畢赤酵母：新發(fā)展的酵母受體細(xì)胞高表達(dá)（12g/L）高穩(wěn)定-----載體為整合型高分泌（10g/L）本文檔共96頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分三）轉(zhuǎn)化

1.原生質(zhì)體法：去除厚壁

2.電穿孔法：效率較高，整合型載體轉(zhuǎn)化前要酶切線性化3.LiCl法：做成感受態(tài)細(xì)胞本文檔共96頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分四）外源基因在酵母菌中的表達(dá)1、胞內(nèi)表達(dá)：直接表達(dá)外源基因，如：HBsAg的酵母重組疫苗2、分泌表達(dá)：在MCS前加入信號肽序列，

pGAPZ,利用因子分泌表達(dá)本文檔共96頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

五）高表達(dá)的策略（1）利用誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子：畢赤酵母表達(dá)載體中常用啟動能力強(qiáng)的GAP啟動子（2）提高整合拷貝數(shù)：可利用載體中提供的抗生素遺傳標(biāo)記，以抗生素加壓篩選含有多拷貝的轉(zhuǎn)化子。（3）控制蛋白酶降解活性：采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改變發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值，或在培養(yǎng)基中補(bǔ)加氨基酸或多肽，均可避免產(chǎn)物被降解。（4）分泌表達(dá)：也是一種避免產(chǎn)物被降解的良好策略。本文檔共96頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分酵母雙雜交系統(tǒng)YeastTwo-HybridSystem本文檔共96頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能通過報告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測得到。

1989年美國紐約州立大學(xué)的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)。蛋白的酵母雙雜交實(shí)驗是以酵母的遺傳分析為基礎(chǔ)，研究反式作用因子之間的相互作用對真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響的實(shí)驗。

本文檔共96頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分很早就已知道，轉(zhuǎn)錄活化蛋白可以和DNA上特異的序列結(jié)合而啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。這種DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄活化蛋白上兩個相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BindingDomain,BD)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(ActivationDomain,AD)分別來完成的，并且這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄活化都是必須的轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNAbindingdomain)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activationdomain)本文檔共96頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響,單獨(dú)存在時沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價或非共價鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子的功能。本文檔共96頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分基本原理

在利用GAL4系統(tǒng)篩選cDNA文庫或研究蛋白間的相互作用時，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶蛋白即“誘餌”相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域與文庫蛋白或要驗證的蛋白相結(jié)合。一般情況下，單獨(dú)的BD可以與GAL4上游活化序列（GALUAS）結(jié)合但不能引起轉(zhuǎn)錄，單獨(dú)的AD則不能與GALUAS結(jié)合，只有當(dāng)BD與AD分別表達(dá)的融合蛋白由于相互作用而導(dǎo)致兩者在空間上相互靠近時，BD與AD才能與GALUAS結(jié)合并且引起報道基因的轉(zhuǎn)錄。本文檔共96頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneXDNA-BDtranscriptiontranscription已知蛋白X與BD-fusion

---誘餌（bait）未知蛋白Y與AD-fusion

---獵物或靶蛋白（preyortargetprotein）報告基因（reportergene）

---LacZ（編碼β-半乳糖苷酶）本文檔共96頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分本文檔共96頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分本文檔共96頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分本文檔共96頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分LacZreporter

-Blue/WhiteScreeningHIS3reporter-ScreenonHis+media(usuallyneedtoadd3ATtoincreaseselectivity)LEU2reporter-ScreenonLeu+mediaADE2reporter-ScreenonAde+mediaURA3reporter-ScreenonUra+media(candonegativeselectionbyaddingFOA)報告基因本文檔共96頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結(jié)合域（BD）融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒將待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域(AD)融合，構(gòu)建成文庫質(zhì)粒將這兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞中酵母細(xì)胞中，已分離的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報告基因的轉(zhuǎn)錄本文檔共96頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分本文檔共96頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)

高敏感性。真實(shí)性。檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。簡潔性。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。廣泛性。采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化時期的材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析不同亞細(xì)胞部位和功能的蛋白質(zhì)，適用于部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白。本文檔共96頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

分析已知蛋白之間的相互作用對蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測蛋白質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)突變或缺失突變再進(jìn)行雙雜交。用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫，再根據(jù)篩的已知基因推測新基因功能。繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜在藥物設(shè)計中的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀本文檔共96頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分進(jìn)行完全的翻譯后修飾可表達(dá)產(chǎn)生有功能的膜蛋白用途：表達(dá)大量的外源蛋白研究基因的功能基因治療兩部分：哺乳動物表達(dá)載體受體：哺乳動物細(xì)胞二、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)本文檔共96頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分1、主要元件2、載體的類型

非病毒性載體

病毒性載體

一）哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體本文檔共96頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分(一）主要元件1）啟動子

病毒來源的：

SV40:綠猴空泡病毒（Simianvacuolatingvirus-40）

CMV:巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus）

RSV:肉瘤病毒（Roussarcomavirus）

ADV:adenovirus（腺病毒）

LTR:逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列（Longterminalrepeatfromretrovirus）

細(xì)胞來源的：

HSP：heatshockprotein（熱休克蛋白）本文檔共96頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分(Promoter+ori)

(PolyA)ori本文檔共96頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分2）增強(qiáng)子許多來源于病毒的增強(qiáng)子在不同種屬細(xì)胞中都有極強(qiáng)的促進(jìn)轉(zhuǎn)錄能力

SV40enhancer

RSVenhancer

CMVenhancer

LTRenhancer本文檔共96頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分3）篩選標(biāo)記胸苷激酶(tk)基因

Thymidinekinasegene二氫葉酸還原酶(dhfr)基因

Dihydrofolatereductase,dhfr新霉素抗性基因

neomycinresistancegene本文檔共96頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分胸苷激酶(tk)基因tk+細(xì)胞中：胸苷(T)→胸苷一磷酸二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

dCTPdATP

dTTP氨基喋呤(Aminopterin)

tk阻斷補(bǔ)加次黃嘌呤（Hypoxanthine）死亡存活DihydrofolateThymidine（1）（2）（3）HAT本文檔共96頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分二氫葉酸還原酶基因篩選法原理攜帶外源基因的載體連接有dhfr基因，可以表達(dá)二氫葉酸還原酶以dhfr-細(xì)胞為受體

:CHO細(xì)胞dhfr-細(xì)胞無法在普通培養(yǎng)基中存活，而轉(zhuǎn)化入dhfr基因后可以存活，并表達(dá)外源基因。若在培養(yǎng)基內(nèi)加入甲氨蝶呤，進(jìn)行加壓篩選，可以提高外源基因表達(dá)量本文檔共96頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分新霉素的類似物G418對原核、真核均有毒neo編碼的酶可使G418滅活此種篩選方法對受體細(xì)胞無要求，應(yīng)用更簡便新霉素抗性基因(neo)本文檔共96頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分4）轉(zhuǎn)錄終止信號和多聚腺苷酸信號

使轉(zhuǎn)錄后的mRNA能有效進(jìn)行切割和多聚腺苷酸化本文檔共96頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分多聚腺苷酸信號本文檔共96頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分5）復(fù)制元件：

使載體在受體細(xì)胞中復(fù)制，提高外源基因的表達(dá)水平6）原核細(xì)胞的部分序列在原核細(xì)胞復(fù)制的復(fù)制起始為點(diǎn)（ori)

在原核細(xì)胞復(fù)制篩選的抗生素抗性基因（AMPr）本文檔共96頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分復(fù)制元件復(fù)制元件本文檔共96頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分

1）非病毒性載體

2）病毒性載體：腺病毒，慢病毒等2、載體的類型本文檔共96頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分1）非病毒型(復(fù)制子型,質(zhì)粒型）由真核復(fù)制信號、啟動子,轉(zhuǎn)錄單位及質(zhì)粒片段組成,不需要包裝細(xì)胞。如：pSV系列、pCDNA3等(二）載體的類型本文檔共96頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分本文檔共96頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分2）病毒型載體

外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重組DNA隨病毒顆粒而復(fù)制(多需輔助病毒或包裝細(xì)胞的存在)。如：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等本文檔共96頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分病毒型載體的類型整合型整合入宿主染色體，隨染色體復(fù)制而復(fù)制可持續(xù)表達(dá)外援基因安全性低：插入誘變

SV40載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體游離型不整合生物安全性高瞬時表達(dá)

腺病毒載體、痘苗病毒載體本文檔共96頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分1、CHO細(xì)胞（中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞）

----------可大規(guī)模培養(yǎng)2、COS細(xì)胞（猴腎細(xì)胞系）：可合成SV40復(fù)制的大T抗原，可使每個細(xì)胞中的SV40載體拷貝數(shù)多達(dá)10萬個，適合于大量表達(dá)SV40載體上的基因3、其他動物的細(xì)胞：如Hela細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）、HEK293細(xì)胞二）受體細(xì)胞------哺乳動物細(xì)胞本文檔共96頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分三）基因轉(zhuǎn)移技術(shù)轉(zhuǎn)化：將質(zhì)粒或以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法。

1.磷酸鈣共沉淀法

2.DEAE-Dextran

3.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：

4.電穿孔法5.顯微注射法6.受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)染：將病毒或以病毒為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法本文檔共96頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期日\18點(diǎn)33分脂質(zhì)體