實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)和分離emma詳解演示文稿

實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)和分離emma詳解演示文稿本文檔共22頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分優(yōu)選實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)和分離emma本文檔共22頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分大腸桿菌（E.coli）分布：人和哺乳動物腸道，此外還廣泛分布于水、污水、土壤、谷類、乳制品等當(dāng)中。大腸桿菌在人體的_____中一般對人體無害，但任何大腸桿菌如果進(jìn)入__________都會對人體產(chǎn)生危害。大腸桿菌是_______工程中被廣泛采用的工具。腸道泌尿系統(tǒng)基因革蘭氏______（填陰或陽）性菌陰代謝類型：異養(yǎng)，兼性厭氧型生長適宜溫度：質(zhì)粒、EcoRⅠ限制酶、E.coli-DNA連接酶、受體細(xì)胞37℃左右本文檔共22頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的培養(yǎng)和分離1.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作2.進(jìn)行大腸桿菌的分離,用固體平板培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的劃線培養(yǎng)3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和操作要求的原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康腖B液體（固體）培養(yǎng)基本文檔共22頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分一、配制培養(yǎng)基培養(yǎng)基：是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。水、碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子(生長因子即細(xì)菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)1、成分區(qū)別于動物培養(yǎng)與植物培養(yǎng)：不加激素固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基的區(qū)別：瓊脂成分作用主要來源碳源主要作能源物質(zhì)無機(jī)碳(CO2)或有機(jī)碳(糖類)氮源合成含N類化合物N2，NH3，銨，硝酸鹽尿素，牛肉膏，蛋白胨無機(jī)鹽調(diào)節(jié)滲透壓等水生長因子調(diào)節(jié)促生長維生素，AA，堿基等如NaCl本文檔共22頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分一、配制培養(yǎng)基不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方實(shí)例：“細(xì)菌喜葷，霉菌喜素”

細(xì)菌培養(yǎng)基要用蛋白胨和酵母提取物來配制，還要加入一定的氯化鈉，以維持一定的滲透壓；霉菌培養(yǎng)基一般用無機(jī)物配制或添加蔗糖的豆芽汁調(diào)節(jié)pH真菌：5～6細(xì)菌：6.5～7.5溶解計算稱量調(diào)pH分裝加塞，包扎滅菌2、過程勿沾到瓶口或者壁上，易污染，則作廢本文檔共22頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分二、包器材封口膜通空氣不通細(xì)菌牛皮紙或報紙加蓋后幾個包在一起接種環(huán)包牛皮紙P20①分裝：注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，因此在將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到三角瓶或試管中時必須用__________。②加塞：試管用塑料蓋或________；三角瓶口用_______或_________封口,再用_________或報紙封口。③包扎：用________或報紙三角漏斗棉花塞封口膜6層紗布牛皮紙牛皮紙250ml裝50ml本文檔共22頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分三、滅菌定義：以化學(xué)劑或物理方法消滅所有微生物（包括芽孢(休眠體)和孢子（真菌、放線菌生殖細(xì)胞））方法1：高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃下維持15min（培養(yǎng)基、無菌水、玻璃器皿等滅菌。P20），滅菌前排出鍋內(nèi)冷空氣，因?yàn)榭諝馀蛎泬捍笥谒魵馀蛎泬?，達(dá)不到水蒸氣的溫度。滅菌鍋壓力與大氣壓相同時打開鍋蓋滅菌后，通常將實(shí)驗(yàn)用具放進(jìn)60～80℃的烘箱中烘干，除去滅菌時的水分，防止污染(P20)方法2：干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。玻璃器皿等耐熱器具惡劣環(huán)境下本文檔共22頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分四、超凈臺操作

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止________污染（培養(yǎng)基和操作者）的方法。雜菌1、紫外消毒（針對空氣）：實(shí)驗(yàn)用具放在超凈臺上，打開超凈臺的紫外燈和過濾風(fēng)（人離開）30min左右，培養(yǎng)基冷卻至60℃，關(guān)閉紫外。2、酒精消毒：用鑷子取出酒精棉擦拭超凈臺桌面，并擦拭雙手。3、開始實(shí)驗(yàn)_________必須無菌（滅菌）_________也必須要無菌（滅菌）_________時不帶入雜菌（滅菌、消毒各種器具培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移菌種滅菌與消毒的區(qū)別本文檔共22頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分滅菌與消毒的區(qū)別消毒：使用較溫和理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部的一部分對人體有害的微生物的過程。不能殺死芽孢和孢子。（對被消毒物體基本無害）滅菌：使用強(qiáng)烈的理化因素消滅物體內(nèi)外所有微生物，包括芽孢和孢子。（細(xì)菌蛋白質(zhì)變性達(dá)到滅菌目的）例題：請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。無菌操作消毒滅菌①高壓蒸汽滅菌②干熱滅菌③灼燒滅菌①紫外線消毒法（使蛋白質(zhì)變性，還能損傷②化學(xué)藥劑消毒法（酒精）③煮沸消毒法400~500℃70%DNA結(jié)構(gòu)④巴氏消毒法本文檔共22頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分四、超凈臺操作倒平板制斜面：冰箱4℃保存單菌落在酒精燈火焰旁，以右手無名指及小指夾持封口膜，右手其他三個手指拿著三角瓶；左手拿著培養(yǎng)皿，并打開上蓋的一邊，將三角瓶中培養(yǎng)基（10~20ml）倒在培養(yǎng)皿里，將其放于水平位置，輕輕晃動，使培養(yǎng)基鋪滿底部，凝固形成平面。倒置放置既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染.試管斜面培養(yǎng)基密閉效果比平面的好很多,不容易進(jìn)入雜菌，同時能用來做純細(xì)菌的長期保存。本文檔共22頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分思考題：A、操作過程中避免帶入雜菌的方法有哪些？1、滅菌后的培養(yǎng)基、器具置于超凈臺上，并打開超凈臺的紫外燈和過濾風(fēng)，滅菌30分鐘。2、用鑷子夾出灑精棉球擦拭桌面和實(shí)驗(yàn)者雙手。3、整個操作在酒精燈火焰旁進(jìn)行4、打開后或加塞前試管口、三角瓶口灼燒滅菌。B、培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60后才倒平板，你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度呢？可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。本文檔共22頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分思考題C、在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。D、如何檢查培養(yǎng)基是否受雜菌的污染？將未接種的培養(yǎng)基放在恒溫箱中培養(yǎng)，若無菌落產(chǎn)生則未受雜菌污染。本文檔共22頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分四、超凈臺操作接種擴(kuò)大培養(yǎng)從大腸桿菌斜面→錐形瓶中的液體培養(yǎng)基接種好后在37度搖床振蕩培養(yǎng)12h注意事項(xiàng):1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復(fù)原.本文檔共22頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分四、超凈臺操作劃線分離法原理：通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。由于劃線過程中接種環(huán)上的菌液逐漸減少，因此最后部分的細(xì)菌間距加大。獲得單菌落首尾注意事項(xiàng):1.接種環(huán)灼燒滅菌后要冷卻，避免溫度高殺死菌種1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次,不能劃破培養(yǎng)基.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)37℃，12~24h本文檔共22頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分第一區(qū)域第二區(qū)域第三區(qū)域第四區(qū)域第五區(qū)域注意1:不能出現(xiàn)線條的重疊注意2:第二次或隨后幾次的操作總是從上一次劃線的末端開始注意3:最后一個區(qū)域不能與第一個區(qū)域相連本文檔共22頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分

平板劃線接種灼燒接種環(huán)冷卻劃線（第一區(qū)域）蘸取菌液灼燒接種環(huán)冷卻劃線（第二區(qū)域）灼燒接種環(huán)冷卻劃線（第三區(qū)域）灼燒接種環(huán)冷卻劃線（第四區(qū)域）灼燒接種環(huán)冷卻劃線（第五區(qū)域）灼燒接種環(huán)平板倒置放置培養(yǎng)本文檔共22頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分第一次灼燒每次劃線之前灼燒劃線結(jié)束灼燒目的避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上的殘留菌種殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境或感染操作者在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。單菌落分離的標(biāo)志？劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落為什么要倒置培養(yǎng)？既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成細(xì)菌隨水?dāng)U散污染，難以分成單菌落，達(dá)不到分離的目的本文檔共22頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分1、系列稀釋操作四、超凈臺操作涂布分離法2、涂布平板操作玻璃刮刀本文檔共22頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分細(xì)菌的分離方法劃線分離法和涂布分離法。

種類:作用:單菌落的分離是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡便方法之一。

劃線分離法，簡單方便；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復(fù)雜些本文檔共22頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分單菌落培養(yǎng)試管斜面培養(yǎng)基密閉效果比平面的好很多,不容易進(jìn)入雜菌，同時能用來做純細(xì)菌的長期保存。在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上，37℃培養(yǎng)24h后，置于4℃冰箱中保存本文檔共22頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期日\13點(diǎn)6分分析與討論:1、如何操作才可以盡量避免被雜菌污染？（