第三章 玻片標本的制作技術

第三章玻片標本的制作技術第一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

制作光學顯微鏡切片標本的方法有如下幾種：

徒手切片法：

采用本法制作切片，一般適用于植物材料。它只可制作一些臨時性使用的玻片標本，而且切片的厚度不均勻，成功率較低。但是制片速度快，所以在植物組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究中，一直使用至今。其切片法方是：用自己的左手持要切片的植物組織，右手拿單面刀片或雙面刀片從外側(cè)向自己的懷中方向切片，把切出的每一張片子都放在培養(yǎng)皿中盛放的水里，然后在水面上挑選厚度均勻、完整的切片，放在載玻片上染色或其它處理后進行觀察。第二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四滑行切片法：這種切片方法是用專門的滑行切片機對經(jīng)過包埋的大塊樣品進行切片，這種技術對生物組織要用火棉膠進行包埋。本方法可對大面積的組織進行切片，但切出的片子不能連成帶狀，只能一片一片的切。本種技術方法在植物木材的教學和研究中應用較多，動物材料的研究一般不用。因此在實驗室內(nèi)一般見不到滑行切片機。第三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

冷凍切片法：

這種切片法是用深低溫冷凍介質(zhì)（液體二氧化碳、半導體冷凍器或?qū)Ｓ梅忾]冷凍切片裝置）對經(jīng)過固定或新鮮的生物樣品冷凍之后，再用專用的切片機進行切片。本法具有出結(jié)果速度快，樣品不需固定等特點。所以在醫(yī)院的病理診斷室應用特別廣，可在5～10分鐘就可得到診斷結(jié)果。本法所使用的切片機冷凍裝置，有用液體二氧化碳的，有用半導體冷凍裝置的，近年來又出現(xiàn)了一種封閉式冷凍切片機，它是將一套切片機安裝在一個密閉的冷凍室內(nèi)，室內(nèi)的溫度可達－20度以下，使用非常方便。但也有它的缺點，主要是不能進行連續(xù)切片，切片的成功率較低。

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石蠟切片：

在制作光學顯微鏡切片標本的技術中，石蠟切片技術是目前最常使用的方法，它可對幾乎所有的生物樣品進行切片，可制成永久保存的玻片標本，本技術程序復雜，操作技術水平要求高，在進行工作前必須做好充分的準備工作第五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四第六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四滑行切片機第七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四封閉式冷凍切片機第八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四輪轉(zhuǎn)式切片機（手搖切片機）第九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四一、實驗前的準備工作

1、器材：恒溫培養(yǎng)箱、電爐子、石蠟切片機、水浴鍋、解剖刀、解剖針、解剖剪刀、鑷子等。有條件的可準備加熱板和展片臺。

2、器皿的準備：解剖盤、培養(yǎng)皿、吸管、吸水紙、青霉素瓶、載玻片、蓋玻片、酒精燈、臺木、硬紙、標簽紙等。3、試劑的準備：固定液、脫水劑、透明劑、染色劑、媒染劑、粘片劑、封片劑等等。第十頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四二、石蠟切片制作的基本步驟與方法制作石蠟切片一般需要經(jīng)過取材固定 清洗（水洗和酒精清洗）脫水透明 透蠟（也稱浸透）包埋包埋塊的修整與裝臺木切片粘片展片干燥脫蠟復水染色（分色和復染） 脫水透明封片貼標簽。從上述步驟可看出，制作石蠟切片技術程序復雜，對每一步都要認真對待，否則會造成結(jié)果不理想或失敗。第十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四一、取材

取材就是指從動物或植物體上以及其他載體上獲取研究和實驗材料的過程叫取材。在石蠟切片中，取材是很重要的步驟，所取的動、植物材料必須新鮮而又要有代表性。不新鮮的或已腐敗的材料制成的切片，不能反映材料的真實情況。1、取材的方法（1）、動物及離體培養(yǎng)細胞的取材：根據(jù)需要用鋒利的刀片從動物的相應部位切取一塊組織，如表面有污物需用生理鹽水稍加清洗，放入固定液中。組織塊的大小要適中，動物組織塊的厚度一般不超過3mm；離體培養(yǎng)的細胞可通過離心的辦法收集細胞沉積團，然后放入固定液中。

第十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四（2）、植物組織的取材：根據(jù)實驗的要求，用利刀切取植物的根、莖或葉片，然后再切成適當?shù)拇笮》湃牍潭ㄒ褐泄潭ā?/p>

2、取材的注意事項：（1）、取材的動作要快，要在較短的時間內(nèi)將取得的組織或細胞放入固定液中。（2）、取材過程中要盡量避免切割、夾持、擠壓對組織、細胞造成的機械損傷，所以在切割時要采取一刀切斷的辦法，不能用拉鋸式切割的方法。（3）、取材的部位必須準確，不需要的組織要盡量去除干凈。第十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四（4）、對時間要求嚴格的樣品，一定要掌握好正確的取材時間。（5）、需要取對比樣品時，一定要取相同一致的部位，如昆蟲的觸角的節(jié)段。二、固定

通過固定劑的作用，將組織、細胞的生活狀態(tài)時的結(jié)構(gòu)完全保存下來的過程叫固定

1、固定的目的（1）、可防止組織細胞的自溶和腐敗。（2）、使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等各種成分沉淀并保存下來。

第十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四（3）、使組織細胞不同的結(jié)構(gòu)部分對光產(chǎn)生不同的折射率造成光學上的差異，增強光學觀察質(zhì)量。（4）、使組織變成適當?shù)挠捕龋员阌诤竺娴奶幚?。只因如此，生物樣品的固定是石蠟切片制作技術中一個非常重要的步驟，根據(jù)不同質(zhì)地的樣品要用不同的固定液對其進行固定，只有這樣才能獲得較好的實驗研究結(jié)果。2、固定劑的選擇標準（條件）用作固定劑的化學物質(zhì)必須具有凝固或沉淀蛋白質(zhì)、脂肪等成分的作用；滲入組織的速度和能力要強；滲透力弱的要和滲透力強的固定劑混合使用，以取長補短成為較完善的固定液?？傊?，一種優(yōu)良的固定劑應具備以下條件：

第十五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四（1）、能迅速滲入組織和細胞殺死原生質(zhì)，以保持細胞的原始形態(tài)結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化。（2）、不會使組織細胞發(fā)生收縮和膨脹。（3）、可以增強細胞內(nèi)含物的折光系數(shù)；可增強媒染作用和著色能力。（4）、能使組織變成適當?shù)挠捕?，可適于切片，但又不能使材料變得太硬而松脆。3、常用固定劑的種類及配方1）、固定劑的種類：在生物顯微制片中所使用的固定劑可分為兩大類，一類是單一固定劑（又稱簡單固定劑），它是由一種化學物質(zhì)構(gòu)成的，如酒精、甲醛（福爾馬林）、冰醋酸、升汞和苦味酸都可以作為單一固定劑來使用。第十六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四單一固定劑固定生物樣品，只能對某些結(jié)構(gòu)成分固定效果較好，而不能將所有的結(jié)構(gòu)成分都保存下來。例如：酒精可以固定糖類物質(zhì)，但不能固定脂類物質(zhì)，因脂類物質(zhì)可溶解于酒精，所以使用單一固定劑有它的局限性。在生物制片技術中常用的是第二種固定劑——混合固定劑。它是由兩種或兩種以上的性質(zhì)不同的化學物質(zhì)混合在一起組成的，它們可彌補各自的不足，對生物樣品固定后，可使細胞內(nèi)的各種成分都得到保存和固定，更有利于保存組織細胞的原始形態(tài)結(jié)構(gòu)。混合固定劑在配制和混合時，必須注意它們各自的物理和化學性質(zhì)，氧化劑和還原劑不能混合使用，如戊二醛和鋨酸。第十七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

2）、常用固定液的配方及其配制方法（1）、單一固定液A、酒精(C2H5OH):它是一種穿透速度快，易引起組織收縮的固定劑。作為固定液使用時，其濃度是70％的水溶液，一般不宜用高濃度的酒精固定生物樣品。B、甲醛（HCHO）：甲醛是一種無色氣體，它以37～40％的量溶于水后就稱為福爾馬林。甲醛是強還原劑，它不能與氧化劑混合使用，而且它又極容易被氧化成甲酸。常用的甲醛固定液是用福爾馬林配制的，一般使用濃度為含純甲醛4～5％的水溶液。這種固定液穿透能力雖不如酒精強，它也會使組織硬化，但組織的收縮小。用福爾馬林固定的樣品有利于細胞核的染色，特別是動物材料效果更佳。第十八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

C、醋酸（CH3COOH）：醋酸是一種穿透能力很強的固定劑，但不會引起組織收縮、硬化；有些組織還會稍有膨脹。所以，它常與酒精、福爾馬林混合使用，以緩解它們對組織的收縮能力。醋酸不能沉淀細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)，但對核蛋白固定效果較好。單獨使用時其濃度為5％的水溶液。D、苦味酸［三硝基苯酚，C6H2(NO2)3OH］：它是黃色結(jié)晶，在空氣中的干粉易燃燒和爆炸，所以在實驗室內(nèi)一般配成飽和水溶液低溫保存。它在水中的溶解度為0.9～1.2%，也可溶于酒精、氯仿、苯及二甲苯中。它可沉淀細胞中所有的蛋白質(zhì)，對脂類和糖類無固定作用。

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用苦味酸固定的樣品，必須在70％酒精中脫苦味酸的黃色，為加快去掉黃色，可向70％的酒精中加幾滴氨水或碳酸鋰水溶液。E、重鉻酸鉀（K2Cr2O7）：它是橙紅色結(jié)晶，有毒。用于固定液的濃度為0.5～2.0％的水溶液。它是強氧化劑，不能與還原劑長期混在一起。重鉻酸鉀在作單獨使用時，對脂類有較好的固定作用，可以固定高爾基體、線粒體，但對核內(nèi)物質(zhì)保存能力很差；如果和醋酸混合使用，pH為4.6時，可以固定核內(nèi)染色體，它不能固定蛋白質(zhì)。用重鉻酸鉀固定的材料，應進行充分的流水沖洗。第二十頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

F、升汞（氯化汞，HgCl2）：氯化汞是一種白色粉末，劇毒。它能固定蛋白質(zhì)、核酸。升汞的穿透能力比醋酸慢，但比苦味酸、鉻酸等快。用含升汞的固定液固定的樣品，對酸性和堿性染色劑的染色效果都很好。經(jīng)含升汞的固定液固定的樣品，須經(jīng)流水進行沖洗12～24小時，而后還要在70％酒精中加碘脫汞。G、四氧化鋨（OsO4）也稱鋨酸：它是一種淡黃色結(jié)晶，空氣中易升華，對粘膜有強烈的刺激作用，其水溶液呈中性，是一種強氧化劑。四氧化鋨是脂類物質(zhì)優(yōu)良的固定劑，對高爾基體、線粒體均有較好的固定效果。第二十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

四氧化鋨的穿透速度很慢。因四氧化鋨易與有機物發(fā)生作用變?yōu)楹谏バ?，所以一般在使用時先用無離子水配成2％的貯存液，用棕色瓶存于40C冰箱中，固定之前再用緩沖液稀釋成1％的濃度，固定時間不宜太長，一般是1.5～2小時，用四氧化鋨固定的樣品需用流水徹底清洗。（2)、混合固定液混合固定液是兩種以上的固定劑混合成一種固定液，常用的混合固定有：

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A、Carnoy，s(卡諾氏)固定液100％的酒精3份冰醋酸1份或者100％的酒精6份氯仿3份冰醋酸1份該固定液最適于細胞核內(nèi)染色質(zhì)的固定，是進行細胞核內(nèi)物質(zhì)研究的優(yōu)良固定液。此液的固定速度快、固定的時間短、不會引起組織的收縮。一般的植物根尖固定20分鐘即可。用這種固定液固定的樣品不需要專門進行清洗。第二十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四B、FAA（福爾馬林－醋酸－酒精）混合固定液福爾馬林5ml50％或70％的酒精90ml冰醋酸5ml此固定液適用于除單細胞及絲狀藻類外的幾乎所有的植物組織新鮮材料的固定。用本固定液固定樣品的時間因材料的不同而異，一般樣品固定的時間為5～12小時，固定后不需要清洗，可直接進入70％的酒精中進行脫水。

C、Bouin，s(包音氏)固定液福爾馬林25ml醋酸5ml苦味酸飽和水溶液75ml第二十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

這種固定液適用于所有動物材料和部分植物材料的固定。它穿透能力強，固定均勻，使組織的收縮小。小塊的材料固定1～幾小時，大多數(shù)的材料需要固定12～24小時。固定后的樣品可直接放入70％的酒精中洗滌并脫苦味酸的黃色。本固定液一定使用新鮮的，要求在用前現(xiàn)配。

D、Zenker，s(任克氏)固定液重鉻酸鉀2.5g升汞5.0g硫酸鈉1.0g醋酸5ml蒸餾水100ml

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配制時應先將升汞溶解于加熱的蒸餾水中，然后再加入重鉻酸鉀和硫酸鈉溶解，使用前再加入醋酸。本固定液是動物各種組織的優(yōu)良固定液。

E、Nawashin，s（納瓦興氏）固定液1％的鉻酸水溶液100ml福爾馬林40ml冰醋酸10ml該固定液可用于植物組織，如對植物根尖、花粉母細胞、染色體、組織的分裂細胞和卵細胞都有良好的固定效果。固定時間為12～24小時，固定后的樣品要用流水沖洗。第二十六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

4、固定的方法對不同的樣品要用不同的固定液進行固定，當組織放入固定液中如果漂在上面（如植物葉片、莖等組織），應采用抽氣的辦法使組織沉于液體底部。在多數(shù)情況下，動物組織的固定要比植物組織的時間短一些，不同的材料，不同的固定液，所需的固定時間差別很大，固定時間短的需要幾分鐘，而長的則需要12～24小時。在固定時所使用固定液的量一定要充足，一般應掌握在所固定組織體積的10～20倍。第二十七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

5、固定的注意事項：（1）、所用固定液一定要新鮮，保存時要放在40C環(huán)境中，不能見強光。（2）、有些混合固定液，某些組分需要在使用前才能加入，否則會發(fā)生不良反應，對這類固定液一定按要求配制和使用。（3）、所用固定液的量一定要充足，否則會使組織得不到充分固定，必要時中間應換幾次新固定液。（4）、在樣品的固定過程中，容器的蓋一定蓋緊，并在容器外面貼好標記，以免混雜。第二十八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四三、清洗動、植物樣品經(jīng)過固定之后，當從固定液中取出，組織的內(nèi)、外存有多余的固定劑，必須進行徹底清洗，將殘存在組織細胞內(nèi)、外未起作用的固定液完全除去，才能進行以后的處理，否則有些固定劑會在組織內(nèi)發(fā)生不良反應，產(chǎn)生沉淀或結(jié)晶，從而影響切片和染色。清洗時可按如下原則進行：1、固定液是酒精、福爾馬林或它們的混合液，一般不需清洗。若需清洗的應使用與固定液中濃度相近的酒精進行清洗。2、用含苦味酸的固定液固定的材料，需用70％的酒精清洗，并在清洗時加幾滴氨水加快脫去苦味酸的黃色。3、用含汞的固定液固定的材料，應根據(jù)所用溶劑的性質(zhì)，用流水或第二十九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四酒精清洗，但在脫水至70％酒精時需加碘酒脫汞。

4、用含鋨固定液或鋨酸固定的材料一定要用流水沖洗。在清洗時如果用酒精作為清洗液，要采用換洗法，即每隔一定時間換一次新液。如果用流水清洗，應將盛樣的容器口用砂布扎緊，然后放在一個水槽中開水龍頭流水沖洗法，這樣可防止樣品被水沖走，造成丟失。流水沖洗時間應等于或大于固定時間(清洗方法見上圖)。四、脫水

用脫水劑逐漸取代掉組織細胞內(nèi)所有水分的過程叫脫水。1、脫水的目的及其脫水劑的種類（1）、脫水的目的：經(jīng)過脫水劑的作用，將組織內(nèi)的所有水分徹底去除干凈，并使組織細胞變成適當?shù)挠捕龋员阌谝院髮悠返奶幚怼?/p>

（2）、脫水劑的種類：脫水劑必須能與水以任何的比例混合，常用的有兩類。

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非石蠟溶劑的脫水劑：這類脫水劑只能與水互溶，不能與包埋劑石蠟互溶。因此用這類脫水劑處理的樣品，在透石蠟之前必須經(jīng)過透明劑（二甲苯）的置換（透明）后，才能進行透蠟處理。這類脫水劑常見的有酒精和丙酮。脫水兼石蠟溶劑的脫水劑：樣品經(jīng)過這類脫水劑處理后，不需要經(jīng)過二甲苯的過渡，可直接進入樣品的透蠟處理，因為這類脫水劑既可與脫水劑酒精互溶又能與包埋劑石蠟互溶,這類脫水劑常見的有正丁烷和二氧六環(huán)等。

第三十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四2、脫水的方法及注意事項1）、脫水的方法：用脫水劑逐漸取代組織中水分的過程叫脫水。常用的脫水劑有酒精和丙酮。最常用的是酒精。如果含水的樣品直接進入高度酒精中，會造成組織收縮、變形、變硬和變脆，所以在脫水時一般采用逐漸脫水的方法。對大多數(shù)動、植物材料而言，可設如下濃度差進行脫水，50％、70％、80％、90％、100％（兩次）。在每一級中脫水的時間，視樣品質(zhì)地不同有較大差異，動物組織每一級脫水10～20分鐘；相同大小的植物組織脫水時間應增加1～2倍方可。第三十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

對一些含水量大，柔嫩的樣品（如動物的胚胎）和要求精細的制片，脫水劑的濃度級差可適當增加，如從10％、20％、30％、40％、50％……2）、脫水時的注意事項（1）、脫水應在帶蓋的容器（如青霉素效瓶）中進行，要防止空氣中的水分進入脫水劑。（2）、在更換脫水劑時，應防止樣品在移動過程中受擠壓和任何損傷。（3）、脫水到高濃度脫水劑，在更換液體時，應防止樣品的自然干燥，因為脫水劑易揮發(fā)，會造成樣品自然干燥。（4）、脫水一定要徹底，否則樣品不易透明，最終造成透蠟不完全，切片失敗。第三十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

至此請同學們注意：如果制作的是植物樣品的石蠟切片，因植物組織細胞與動物的有很大差別，它的組織內(nèi)有木質(zhì)纖維，細胞表面有細胞壁，細胞內(nèi)有較大的液胞，這些特殊的結(jié)構(gòu)不僅可阻止一些液體的浸透速度，而且經(jīng)過脫水后很堅硬，如不對其進行軟化，包埋的組織塊其切削性能不好，就不能切出理想的切片。因此，在制作纖維化程度較高的植物樣品（如植物的幼莖、葉脈等）時，在固定洗滌結(jié)束后，一定要對其進行軟化，其方法是用10％～20%的氫氟酸水溶液進行軟化樣品，軟化的時間因樣品的質(zhì)地不同而異，對不同的樣品需要進行試驗摸索。一般情況下一些較幼嫩的植物莖，在15％的氫氟酸水溶液中浸泡7～15天就可滿足要求。另外，氫氟酸對金屬和玻璃容器有很強的腐蝕作用，在配制和處理樣品時使用的容器一定要用塑料的。第三十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

五、透明1、透明的目的

在石蠟切片制作過程中，透明是一個非常關鍵而重要的步驟，整個制片過程中需進行兩次透明，一次是在樣品經(jīng)過脫水之后，必須對樣品進行透明（置換）處理，這樣才能保證包埋劑石蠟浸透到組織細胞的各個部位；第二次透明是在切片經(jīng)過染色、脫水之后，也要對染色后的切片進行透明（可增強染色后切片的透明度和不同結(jié)構(gòu)對照明光線的折射能力），才能進行封片。

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對組織和細胞的透明其目的是：因脫水劑大都用酒精，它是非石蠟溶劑的脫水劑，所以脫水后的樣品必須經(jīng)二甲苯透明后，才能使包埋劑石蠟滲入到組織細胞的各個部位，凝固后起到良好的支撐作用，使組織塊有良好的切削性能，以便切出厚度合適而均勻的切片。對染色后的切片透明的目的是：通過透明改變細胞切片中個組成部分對入射光的折射性能，使視野中所觀察到的結(jié)構(gòu)圖像襯度好、清晰度高。第三十六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

2、常用透明劑及其種類透明劑應該是石蠟的溶劑，大部分不能與水互溶。常用的透明劑有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油、冬青油等。目前在石蠟切片的制備中最常用的是二甲苯，其它透明劑只是在特殊需要時才使用，二甲苯既可用于動物組織及其切片的透明，也可用于對植物組織和切片的透明。

第三十七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四3、透明的方法動、植物組織的透明，一般用逐漸提高透明劑的濃度，最終換入純透明劑進行透明的方法，基本操作是：3：1的無水酒精：二甲苯；2：1的無水酒精：二甲苯；1：1的無水酒精：二甲苯；純二甲苯二次。在各級中處理的時間動物與植物樣品有較大的差異，一般是20分鐘到1小時，最長不能超過3小時。同樣大小的植物樣品，在每級中透明的時間要延長。第三十八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

4、透明應注意的問題（1）、透明過程中要及時蓋好容器的蓋子，防止空氣中的水分進入透明劑。（2）、在更換每級液體時動作要快，這樣既可防止樣品的自然干燥，也可減少周圍空氣中水分的進入。（3）、如果加入透明劑，變成不透明的霧狀，說明樣品脫水不徹底，應退后到純酒精中重新脫水，然后再進行透明處理。第三十九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四六、透蠟（浸透）在石蠟切片中，組織細胞內(nèi)的每個空間都是以石蠟凝固后來支撐的，只有這樣才能切出理想的切片。所以，當組織細胞經(jīng)過脫水和透明之后，應當將組織浸泡在不斷提高濃度的液態(tài)石蠟中，用純石蠟將組織內(nèi)外的透明劑逐漸取代掉，并占居每個空間，這一過程叫透蠟（浸透）。切片樣品必須經(jīng)過徹底的透蠟，才能保證樣品在包埋后能切出較理想的切片。

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石蠟是在進行石蠟切片時常用的包埋劑，對各種不同的樣品在包埋時選擇不同硬度的石蠟是十分重要的。1、包埋劑的種類及其選擇原則包埋劑就是一種支持劑，經(jīng)它浸透和包埋凝固變硬后，使組織具有一定的硬度，也使組織細胞與包埋劑形成一個完整的整體，以便于在切片機上切片。根據(jù)不同的切片方法，常見的包埋劑有石蠟、火棉膠、碳蠟（水溶性）和明膠等。

第四十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

石蠟：它是從石油中提煉的，是在生物醫(yī)學界制作動、植物切片最常用的包埋劑。根據(jù)熔點的不同，石蠟可分為軟蠟和硬蠟兩種類。軟蠟的熔點低（熔點在42度～54度范圍），一般分為42度～50度；45度～52度或48度～54度等等不同熔點的。硬蠟的熔點較軟蠟高（熔點在54度～60度范圍內(nèi)），一般分為54度～58度；56度～60度或54度～60度等等不同熔點。其它幾種包埋劑在此不作介紹了。第四十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

石蠟的選擇原則如下：A、所選用石蠟的硬度要與樣品的硬度相近，樣品較硬時要選硬蠟，反之則選軟蠟。B、根據(jù)所需切片的厚度來選擇石蠟，需要切片較厚時，要用硬蠟；而需要8微米以下的切片，要用軟蠟。C、根據(jù)季節(jié)的不同（室內(nèi)溫度的不同）來選擇石蠟，這是十分關鍵的原則。對相同質(zhì)地的樣品，在夏季（室溫較高）制作切片時，要用熔點高的石蠟（硬蠟）；而在冬季制片時，要用軟蠟。但是無論什么季節(jié)，如果選用的石蠟太硬，切片很容易碎，不易切成連續(xù)的蠟帶；如果選用的石蠟太軟，則切片很容產(chǎn)生皺縮，粘片展片時很難展平。

第四十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

根據(jù)經(jīng)驗通常室溫在15～25度時，選用52～54度的石蠟；冬季室內(nèi)無恒溫設備時，用46～48度的石蠟；夏季室溫較高時，選用56～58度的石蠟較好。如果選用的石蠟硬度不合適，也可在切片時進行補救，方法是加溫或降溫。2、透蠟的方法樣品經(jīng)過透明處理后，對動物組織而言，可換入透明劑與石蠟等量混合液中30～幾小時，然后在恒溫培養(yǎng)箱或熔蠟爐內(nèi)順次換入純石蠟I、純石蠟II中各2小時即可。

第四十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四第四十五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四植物組織的透蠟要比動物組織復雜而且用時也長。要采用逐漸提高石蠟濃度和逐漸提高溫度增加石蠟在透明劑中比例的方法進行透蠟，必要時先用軟蠟透蠟，再用硬蠟透蠟。其方法是：（1）、在250C下逐漸向透明劑中加石蠟，使石蠟達飽和狀態(tài)透蠟2小時以上。（2）、在350C下再加石蠟至飽和狀態(tài)透蠟2～6小時。（3）、在450C下再加石蠟至飽和狀態(tài)透蠟6～12小時。（4）、用熔點為54～560C的純石蠟I、純石蠟II、純石蠟III各透蠟2～3小時。一些植物樣品的透蠟有時還要抽真空，以加快透蠟的速度，也可延長透蠟的時間。第四十六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

3、透蠟的注意事項

（1）、透純石蠟時熔化的石蠟溫度不能太高，一般高于所用石蠟熔點的2～30C即可，溫度過高會對樣品造成熱損傷。（2）、對不同質(zhì)地的樣品和室內(nèi)溫度的不同，正確的選擇所用石蠟的熔點，熔點越高石蠟的硬度就越大。（3）、應正確的掌握透蠟時間，既要透蠟完全，也應盡量縮短透蠟的時間。透蠟時間越長，組織的硬度和脆性就增大，所以，必要時可采取抽真空的方法進行透蠟（一些植物組織常采用抽真空法進行透蠟）。

第四十七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

七、包埋

包埋就是在一定的容器內(nèi)用包埋劑（純石蠟）對經(jīng)徹底透蠟的組織、細胞進行包被，使石蠟冷卻固化后與組織形成一體的塊狀結(jié)構(gòu)的過程。1、包埋前的準備工作：在透蠟時間即將結(jié)束時，必須做好包埋前的各項準備工作。首先應疊好包埋容器（紙盒），準備好酒精燈；眼科鑷子和吸管要提前放到熔蠟的溫箱內(nèi)預熱；準備一盆冷水，用來冷卻石蠟。

第四十八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四包埋盒的折疊方法：（1）、折AA，和BB，；（2）、折CC，和DD，（3）、折CE，與AE，折痕相疊，向外夾出EE，。同樣折出FF，、GG，和HH，；（4）、使E，CE與?E，IE兩三角形相疊，并沿E，C和EI重疊的折痕向后轉(zhuǎn)折。用相同的方法折其余的三只角；（5）、折EIJF向外，同樣折GKIH向外，即疊成所需要的包埋用紙盒了。第四十九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四

2、包埋的方法：

整個包埋過程應在熔石蠟的溫箱門前進行。因為溫箱內(nèi)熔化的純石蠟只高于熔點的2～3度，從溫箱內(nèi)取出就會凝固。首先把包埋紙盒內(nèi)加入少量熔化的石蠟，然后用溫箱內(nèi)預熱的鑷子從最后一級純石蠟內(nèi)夾取一塊組織放到包埋盒內(nèi)，并調(diào)整好樣品的方向和位置，再用液體石蠟加滿包埋紙盒；將鑷子在酒精燈上加熱，伸入包埋盒內(nèi)在樣品的周圍轉(zhuǎn)幾圈，主要是為了趕出樣品周圍的氣泡。這時即可用雙手持包埋盒的兩耳放入冷水表面，等包埋盒內(nèi)的石蠟凝固后再松開手，使石蠟達到完全凝固即可取出備用。

第五十頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四3、包埋時的注意事項：1）、所用石蠟一定要純，如從外觀看有顆粒狀雜質(zhì)時，需熔化過濾后再使用。

2）、新石蠟要經(jīng)過多次的熔化凝固再使用，這樣可趕出石蠟中的氣體和水分。

3）、包埋的樣品一定要在包埋盒的兩耳上做好標記，避免樣品的混淆。4）、包埋過程中不要將液體石蠟弄得到處都是，因為石蠟不好擦洗。5）、如果用電爐子熔化石臘，一定要有人看守，而且溫度不能太高，否則會引起石蠟的燃燒發(fā)生火災。6）、包埋用的液體石蠟溫度不能太高，一般高于熔點的2～3度，溫度太高會損傷樣品。第五十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四八、切片、貼片和片展1、切片機：樣品包埋結(jié)束就要進行切片，所使用的儀器叫切片機，進行石蠟切片的叫石蠟切片機（有的書上也叫手搖切片機或輪轉(zhuǎn)式切片機）。石蠟切片機的基本結(jié)構(gòu)是由樣品臂、樣品推進器、切片厚度調(diào)節(jié)器、切片刀座、手搖輪和切片機底座構(gòu)成的。2、切片刀：石蠟切片所使用的刀是金屬材質(zhì)的，刀口十分鋒利，根據(jù)切片刀的形狀可分為平凹型、雙凹型和平楔型三種類型（分別見右圖A、B、C）。第五十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四第五十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四切片刀的長度根據(jù)用途不同而異，一般情況下石蠟切片刀的長度是12cm；滑行切片機用得到最長是14～20cm；冷凍器片機的刀是8cm。切片刀不鋒利時需要磨，磨刀有兩種方法，一種是人工磨刀法；另一種是用磨刀機磨。人工磨刀法需要有一定的專業(yè)技術水平，否則會把刀磨壞的。其技術要點是：刀在磨石上的運行速度、方向和刀口接觸磨石的均勻度及壓刀的用力（見右圖所示）。磨石根據(jù)使用的研磨介質(zhì)可分為兩種，一種是以水作為研磨介質(zhì)的叫水磨石；另一種是用甘油作研磨介質(zhì)的叫油磨石。第五十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四切片刀的研磨很用時間，一把在顯微鏡低倍物鏡下觀察有鋸齒缺刻的刀，一個技術熟練的人磨，上班時間就磨刀大約需要一周時間。所以切片倒要好好保存使用，要由專人負責管理。機械磨刀是用磨刀機，將要磨的刀夾到夾持器上，加上研磨膏，打開磨刀機電源，設定好刀的運行速度以及刀翻轉(zhuǎn)的時間后，讓其自己磨就可以了，到了時間取下刀就可以使用了。

3、切片的步驟和方法1）、包埋塊的修正：將包埋有樣品的石蠟塊用單面或雙面刀片進行修整。以準備切片的面和準備向臺木上沾的面作為兩個對應平面，將四個側(cè)面修成相互對稱而平行的面，并將切片面樣品前端的石蠟在不損傷樣品的前提下盡量去干凈，樣品四周留1～2毫米的石蠟。

2）、將修好的組織塊固定到準備好的臺木上：臺木是一塊1.5～2cm見方的結(jié)構(gòu)致密的優(yōu)質(zhì)木材做成的，第五十五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期四新做的臺木要用液體石蠟浸泡24小時，使其浸滿石蠟，這樣修好的組織塊沾上后才牢固。臺木也可用金屬的代替，有個別的石蠟切片機上配備有，但它不如木質(zhì)的好用（見右圖）。向臺木上沾修好的組