吉非替尼對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制作用與PTEN表達(dá)的關(guān)系

吉非替尼對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制作用與PTEN表達(dá)的關(guān)系【摘要】目的觀察表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼對人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制作用，探討這種作用與結(jié)腸癌細(xì)胞PTEN表達(dá)的關(guān)系。方法應(yīng)用體外藥物敏感實驗檢測吉非替尼對6種人結(jié)腸癌細(xì)胞系的生長抑制作用；應(yīng)用RT-PCR檢測不同結(jié)腸癌細(xì)胞中PTENmRNA水平；應(yīng)用Westernblot檢測結(jié)腸癌細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)水平。結(jié)果吉非替尼在體外對6種結(jié)腸癌細(xì)胞系的生長抑制作用差異很大。吉非替尼作用濃度為1μmol/L時，Lovo細(xì)胞系抑制率達(dá)34%，對吉非替尼最為敏感，其半量抑制濃度10μmol/L；HT29和SW480為中度敏感；而HCT116、LS174T和SW620不敏感，其IC50>100μmol/L。各個細(xì)胞系中PTENmRNA和PTEN蛋白均有表達(dá)。結(jié)論吉非替尼對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制作用與PTENmRNA和PTEN蛋白表達(dá)水平無明顯相關(guān)，即PTEN表達(dá)狀態(tài)還不能作為預(yù)測結(jié)腸癌對吉非替尼敏感性的可靠生物學(xué)指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】結(jié)腸腫瘤；細(xì)胞系；PTEN；吉非替尼；生長抑制

RelationshipbetweenPTENexpressionsandinhibitoryeffectsofGefitinibonthegrowthofcoloncancercells

【Abstract】ObjectiveToobservetheinhibitoryeffectofGefitinib,aselectiveoralepidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitor,onthegrowthofhumancoloncancercells,andinvestigatetherelationshipbetweenthesensitivityofcoloncancercellstoGefitinibandPTENexpressions.MethodsTheinhibitoryeffectsofGefitinibon6kindsofcoloncancercells,thelevelsofPTENmRNAindifferentcoloncancercells,andPTENproteinexpressionsincoloncancercellsweredetectedbyMTTassay,RT-PCRandWesternblot,respectively.ResultsTheinhibitoryeffectsofGefitinibonthe6coloncancercellsinvitrovariedalot.WhentheconcentrationofGefitinibwas1μmol/L,LovocellshadthemostsensitivitytoGefitinibwithanIC5010μmol/L;HT29andSW480hadmoderatesensitivity,andtheIC50rangedfrom10μmol/Lto100μmol/L;HCT116,LS174TandSW620wereinsensitivetoGefitinib,andtheirIC50100μmol/L.AllthecoloncancercelllinesexhibitedPTENmRNAandproteinexpressions.ConclusionsPTENmRNAandproteinexpressionsmightnotbeassociatedwiththeinhibitoryeffectsofGefitinibonthegrowthofcoloncancercells.TheexpressionofPTENcannotbetakenastheindicationofthesensitivityofcoloncancercellstoGefitinib.

【Keywords】Coloncancer;Cellline;PTEN;Gefitinib;Growthinhibition

吉非替尼是目前備受關(guān)注的靶向治療藥物，是一種具有口服活性的選擇性表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，能阻斷EGFR激活的多條信號通路。吉非替尼對不同的結(jié)腸癌細(xì)胞系均表現(xiàn)出不同程度的抗腫瘤活性［1-2］。PTEN是一種具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，當(dāng)PTEN功能減弱或缺失，可引起EGFR下游通路中的Akt過度活化，降低細(xì)胞對凋亡的敏感性。本文將探討結(jié)腸癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性與PTEN表達(dá)的關(guān)系。

1材料與方法

細(xì)胞系培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞系Lovo、HCT116、HT29為本室傳代保存，LS174T、SW480、SW620購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。SW620用LeibovitzL-15培養(yǎng)液，其余以DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中含10%胎牛血清，各100U/ml的青霉素、鏈霉素，用%胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于各項實驗。

藥物和主要試劑

吉非替尼溶解于二甲基亞砜中，儲存濃度為200mmol/L，-20℃保存，僅在每次實驗前用新鮮培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，作用于細(xì)胞的DMSO濃度不超過%。

二甲基四氮唑藍(lán)、DMSO等購自美國Sigma公司；Tripure為瑞士Roche公司產(chǎn)品；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶為美國Promega公司產(chǎn)品；混合Taq酶為北京天為時代科技有限公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；抗PTEN抗體購自美國CellSignalingTechnology公司；內(nèi)參β-肌動蛋白抗體購自美國SantaCruzBiotechnology公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國PierceBiotechnology公司。

體外藥物敏感實驗

調(diào)整細(xì)胞濃度后取100μl以每孔含細(xì)胞數(shù)5000個接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃孵育24h后，每孔加入含不同藥物濃度的完全培養(yǎng)液100μl，對照組不含藥物只加入等量的DMSO，每組設(shè)4個復(fù)孔，繼續(xù)孵育72h。每孔加20μl二甲基四氮唑藍(lán)液，培養(yǎng)4h后小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入200μlDMSO。用Model550型酶標(biāo)儀在490nm下測吸光值，計算藥物的細(xì)胞生長抑制率：抑制率＝×100%，并求出半量抑制濃度，每個實驗重復(fù)3次。RT-PCR檢測

按Tripure試劑說明提取細(xì)胞總RNA，取2μgRNA合成cDNA。根據(jù)GeneBank提供的PTENmRNA序列設(shè)計合成引物。上游引物：5′-GGTTCACATCCTACCCCTTTG-3′，下游引物：5′-CATTCTTTGTTGA-TAGCCTCCA-3′，產(chǎn)物長度453bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min；94℃30s，56℃30s，72℃90s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。以磷酸甘油醛脫氫酶為內(nèi)參照，產(chǎn)物長度715bp。

Westernblot檢測

以RIPA細(xì)胞裂解液提取各種細(xì)胞總蛋白。以Bradford法測定蛋白濃度。取各組50μg蛋白上樣，經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。抗PTEN一抗4℃孵育過夜。HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，避光顯影檢測雜交信號。

統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)用x±s表示，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析。為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

結(jié)腸癌細(xì)胞系對吉非替尼的敏感性

吉非替尼在體外對6種結(jié)腸癌細(xì)胞系的生長抑制作用差異很大。在吉非替尼作用濃度為1μmol/L時，Lovo結(jié)腸癌細(xì)胞系的抑制率已達(dá)34%，

結(jié)腸癌細(xì)胞系PTENmRNA表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，Lovo、HCT116、HT29、LS174T、SW480和SW620結(jié)腸癌細(xì)胞系均不同程度表達(dá)PTENmRNA。其灰度值依次為±，±，±，±，±，±，其中LS174T表達(dá)最強，其他細(xì)胞系間無差異。

結(jié)腸癌細(xì)胞系PTEN蛋白表達(dá)

Westernblot檢測結(jié)果可見，Lovo、HCT116、HT29、LS174T、SW480和SW620結(jié)腸癌細(xì)胞系的PTEN蛋白均有表達(dá)，但表達(dá)相差不大，見圖4。其灰度值依次為±，±，±，±，±，±。

各結(jié)腸癌細(xì)胞系對吉非替尼的敏感性與相應(yīng)PTEN表達(dá)水平的關(guān)系

Lovo細(xì)胞系對吉非替尼最為敏感，LS174T、HCT116和SW620的敏感性最差，耐藥倍數(shù)是Lovo的20～30倍，而PTEN表達(dá)在Lovo與耐藥細(xì)胞之間的差異性卻不明顯。另外HT29和SW480屬中度敏感，但其PTEN表達(dá)與對吉非替尼最不敏感和最敏感的結(jié)腸癌細(xì)胞之間相差也不明顯。

3討論

目前，吉非替尼對結(jié)腸癌細(xì)胞生長抑制作用的研究多集中于EGFR和磷酸化EGFR表達(dá)以及EGFR酪氨酸激酶域突變［3］。然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變在結(jié)腸癌中并非一個常發(fā)事件，并且EGFR活性也不能完全決定腫瘤細(xì)胞對吉非替尼的敏感性［4］。EGFR的下游信號通路并不為藥物所阻斷，可能是細(xì)胞內(nèi)的信號發(fā)生變異，不依賴EGFR轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［5］。PI3K/Akt通路是EGFR下游信號通路的關(guān)鍵組成部分，在腫瘤細(xì)胞對吉非替尼產(chǎn)生耐藥時PI3K/Akt通路活性也有所改變。當(dāng)PTEN功能減弱或缺失，在細(xì)胞膜上磷脂酰肌醇三磷酸鹽積聚，將引起Akt的異常活化。PTEN在多數(shù)惡性腫瘤中表達(dá)降低或缺失，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，而且在PI3K/Akt通路中最易發(fā)生活性改變［6］。

本研究入組結(jié)腸癌細(xì)胞系以RT-PCR和Westernblot檢測PTENmRNA和PTEN蛋白均有不同程度表達(dá)，其中mRNA水平以LS174T表達(dá)最強，而在蛋白水平LS174T和其他細(xì)胞系差異不明顯。這可能與轉(zhuǎn)錄后的蛋白翻譯和修飾有關(guān)。研究結(jié)果與國外文獻(xiàn)報道相符［7］。PTEN表達(dá)缺失在結(jié)腸癌可能并不常見，也許PTEN多表現(xiàn)為表達(dá)減弱或功能失活。

本研究觀察了6種人結(jié)腸癌細(xì)胞系對吉非替尼的敏感性，其結(jié)果與大多文獻(xiàn)報道的結(jié)腸癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性基本相符［2，8］。關(guān)于腫瘤細(xì)胞PTEN表達(dá)與吉非替尼敏感性的關(guān)系觀點尚不一致。惡性膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞系具有野生型PTEN，且功能完整，磷酸化Akt處于低表達(dá)水平，而該細(xì)胞系對吉非替尼的生長抑制作用并不敏感，認(rèn)為PTEN表達(dá)與耐藥機制無關(guān)［9］。臨床研究以免疫組織化學(xué)染色法檢測93例非小細(xì)胞肺癌患者PTEN的表達(dá)狀況，發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)缺失與磷酸化Akt表達(dá)水平和患者對吉非替尼的治療反應(yīng)性無明顯相關(guān)，推斷PTEN不是預(yù)示非小細(xì)胞肺癌原發(fā)性耐藥的生物學(xué)指標(biāo)［10］。

然而也有結(jié)論不一致的研究，認(rèn)為PTEN的表達(dá)狀態(tài)與吉非替尼耐藥有關(guān)。吉非替尼誘導(dǎo)MDA-468乳腺癌細(xì)胞系產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥后，PTEN出現(xiàn)突變或表達(dá)缺失以及PI3K/Akt活性上調(diào)。以腺病毒轉(zhuǎn)染野生型PTEN到PTEN表達(dá)缺失的耐藥腫瘤細(xì)胞中，可觀察到PI3K/Akt活性降低以及對吉非替尼反應(yīng)性提高［11］。PTEN表達(dá)下降或缺失是引起非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系對吉非替尼原發(fā)性耐藥的機制之一，下調(diào)PI3K/Akt活性可使治療敏感性恢復(fù)或提高［12］。對于以上不同的觀點，分析原因除了藥物敏感性與腫瘤組織類型、檢測PTEN表達(dá)的手段有關(guān)以外，更重要的是腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜性，這一特性使得很難由單一因素確定細(xì)胞對藥物敏感性的高低。

總之，腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜性和網(wǎng)絡(luò)性決定了尋找反映吉非替尼敏感性指標(biāo)的艱巨性。本研究通過觀察吉非替尼對6種人結(jié)腸癌細(xì)胞系的生長抑制作用與PTEN表達(dá)的關(guān)系，認(rèn)為PTEN表達(dá)狀態(tài)還不能作為預(yù)測結(jié)腸癌對吉非替尼敏感性的可靠的生物學(xué)指標(biāo)。

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