新的腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良基因突變1例的鑒定

新的腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良基因突變1例的鑒定【摘要】目的：對1例腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良患者及其家系成員的ALD基因的突變類型進(jìn)行鑒定.方法：以外周血RNA為模板，采用長鏈RTPCR技術(shù)，分4個(gè)片段擴(kuò)增ALD基因mRNA的編碼序列，對4個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，篩查整個(gè)基因編碼區(qū).通過限制性內(nèi)切酶酶切分析患者及其家系成員基因組ALD基因片段，以進(jìn)一步確證所發(fā)現(xiàn)的基因突變.結(jié)果：位于患者ALD基因第6外顯子的第508位密碼子存在一個(gè)新的錯(cuò)義突變CCC→CTC(P508L)，患者母親為突變攜帶者，患者父親和妹妹不存在此突變.結(jié)論：發(fā)現(xiàn)中國ALD患者一個(gè)新的ALD基因突變，即P508L突變.

【關(guān)鍵詞】腎上腺白質(zhì)營養(yǎng)不良；ALD基因；突變，誤義；ALD蛋白

0引言

腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(ALD,adrenoleukodystrophy)是最常見的一種遺傳性中樞神經(jīng)髓鞘合成病變［1］.致病基因位于X染色體，編碼一個(gè)有745個(gè)氨基酸殘基的過氧化物酶體膜蛋白，即ALD蛋白.我們對1例腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良患兒及其家庭成員的ALD基因突變進(jìn)行了分析.

1對象和方法

1．1對象男，7歲，漢族，福建省周寧縣人，因進(jìn)行性視力下降、步態(tài)不穩(wěn)1a余入院.檢查：神志清楚，對答尚切題，言語含糊，不配合，雙眼視力光感，吞咽困難，飲水嗆咳.心、肺、肝、脾未見異常.腦電圖中度異常，體感誘發(fā)電位異常.顱腦MRI示枕頂部蝶形長T1和長T2信號的病灶.氣相色譜查患者血漿24碳飽和脂肪酸濃度：mg?L-1,22碳飽和脂肪酸濃度：mg?L-1，兩個(gè)濃度比等于(正常范圍左右).患者非近親婚配所生，另有一妹妹，無家族史.臨床診斷：腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良.

1．2方法ALD基因的mRNA長kb，其中編碼區(qū)為2238bp.本研究合成4對引物［2］，即：PIF和RT1,PⅡF和RT2,PⅢF和RT3,PⅣF和RT4，分4段對ALD基因編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)期大小分別是722,700,723和646bp，其中ALD1的3′端和ALD2的5′端部分重疊，ALD2的3′端和ALD3的5′端部分重疊，ALD3的3′端和ALD4的5′端部分重疊.若以PIF和RT4為引物對擴(kuò)增ALD基因cDNA，預(yù)期片段大小是2440bp.引物委托上海生工生物工程公司合成.

1．2．1長鏈RTPCR及測序從患者取新鮮抗凝血~3mL，按Qiagen產(chǎn)品說明書提取總RNA.長鏈RTPCR按TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行.先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后在PE2400型熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃變性2min后，按94℃30s,60℃30s,72℃2min循環(huán)30次.最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)在72℃延伸8min.將上述PCR混合物10~20μL上樣于15g?L-1的瓊脂糖凝膠電泳，切下含預(yù)期片段的膠塊，利用Qiagen的DNA凝膠回收試劑盒從膠塊中回收DNA.以此DNA為模板，組配4個(gè)2次PCR反應(yīng)：反應(yīng)體積50μL，含模板1ng,引物各25pmol,4種dNTP各mmol?L-1,Taq酶U,MgCl2mmol?L-1，分別擴(kuò)增ALD1,ALD2,ALD3,ALD4，擴(kuò)增條件統(tǒng)一為：94℃預(yù)變性2min后，按94℃30s,50℃30s,72℃60s進(jìn)行10~15個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)在72℃延伸9min.用Qiagen的PCR產(chǎn)物純化試劑盒直接從PCR混合液中純化PCR產(chǎn)物.將純化的4個(gè)片段連同相應(yīng)PCR引物，寄上海博亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定.

1．2．2基因組DNA片段擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶分析患者及其家庭成員的外周血基因組DNA使用Qiagen的DNA提取試劑盒提取.根據(jù)突變所在部位，用Omiga軟件設(shè)計(jì)針對外顯子6全長序列的PCR引物，上游引物(PA5F)序列為：5′CTGCGCTCTCTGGCGTCA3′，下游引物序列為：5′CACAGCCCGTCTCTGGCT3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長330bp.擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性4min后，按94℃30s,55℃30s,72℃30s進(jìn)行30個(gè)循環(huán).用Qiagen的PCR產(chǎn)物純化試劑盒從PCR混合液中純化PCR產(chǎn)物.根據(jù)突變的性質(zhì)，用限制性內(nèi)切酶BspLI對純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切,于100g?L-1聚丙烯酰胺凝膠上電泳,溴化乙啶染色后用美國BioRad公司的FluorS型凝膠成像儀采集電泳結(jié)果.

2結(jié)果

2．1ALD基因mRNA的RTPCR擴(kuò)增及測序用長鏈RTPCR試劑盒對患者外周血ALD基因mRNA的整個(gè)編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得預(yù)期的擴(kuò)增片段，也可見一些非特異性片段.為提高特異性，并獲得足夠的PCR產(chǎn)物，先從凝膠中回收上述覆蓋整個(gè)編碼區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后分4段進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng).2次PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(Fig1)，14依次是ALD4,ALD3,ALD2和ALD1，4個(gè)片段均獲得特異性擴(kuò)增，其大小與預(yù)期完全相符.直接用Qiagen試劑盒從2次PCR混合物中純化ALD1,ALD2,ALD3,ALD44個(gè)片段后，用美國ABI公司的BigDye系統(tǒng)分別對其進(jìn)行序列測定.正常對照(Fig2A)和患者(Fig2B)ALD3片段部分序列，序列下劃線處示發(fā)生突變的密碼子部位.結(jié)果顯示，患者ALD基因mRNA僅有一個(gè)堿基發(fā)生改變，即第508個(gè)密碼子發(fā)生了CCC→CTC的改變，使正常的脯氨酸被亮氨酸替換.正、反向測序結(jié)果一致.

圖1-圖2(略)

2．2限制性內(nèi)切酶分析以患者及其家庭成員的基因組DNA為模板，擴(kuò)增突變所在的ALD基因第6外顯子，擴(kuò)增片段330bp.正常情況下，該片段內(nèi)含有2個(gè)BspLI酶切位點(diǎn)，酶切后產(chǎn)生72,34和224bp3個(gè)片段.患者第508密碼子的CCC→CTC突變導(dǎo)致72與34bp片段之間的酶切位點(diǎn)消失，酶切結(jié)果產(chǎn)生106和224bp2個(gè)片段.酶切后的電泳結(jié)果(Fig3)，可以看出：患者父親和妹妹的酶切模式為正常人模式，患者的酶切模式與預(yù)期相符，患者母親的酶切圖譜中既有106和224bp兩個(gè)片段，也有72和34bp兩個(gè)片段，為雜合子.以上結(jié)果還經(jīng)過對330bp片段的直接序列測定證實(shí).

圖3患者及其家庭成員ALD基因外顯子6擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切分析(略)

3討論

本患者6歲起病，以進(jìn)行性視力下降等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主，病程進(jìn)展迅速，頭部MRI查出典型的大腦頂枕部長T1和長T2信號病灶，血漿極長鏈飽和脂肪酸濃度升高，符合兒童大腦型ALD的臨床診斷［1］.

ALD表現(xiàn)出高度的遺傳異質(zhì)性.根據(jù)有關(guān)國際權(quán)威數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)，目前在全球ALD患者中已鑒定出500多個(gè)ALD基因突變，其中有一半以上僅見于單一家系.本病在臨床表現(xiàn)方面也是高度異質(zhì)的，同一家族的不同患者在起病時(shí)間和臨床癥狀上也往往不盡相同［3］.表現(xiàn)型的異質(zhì)性說明開展臨床基因診斷的必要性，但遺傳的高度異質(zhì)性又使臨床基因診斷的開展面臨較大困難.我們曾報(bào)道在中國ALD患者發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)基因突變［2,4］，本例P508L突變是在中國人群發(fā)現(xiàn)的第2個(gè)ALD基因突變.查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，尚未見有關(guān)此突變的報(bào)道.以下幾點(diǎn)支持該突變是病理性突變的觀點(diǎn)：①患者的ALD基因的整個(gè)編碼區(qū)只存在一個(gè)堿基改變，其余部分與正常對照的序列和GenBank參考序列一致；②患者父親和妹妹的ALD基因不存在該突變，其母親為攜帶者，與ALD作為X染色體隱性遺傳病的特點(diǎn)符合；③突變使ALDP的第508位氨基酸由Pro變成另一個(gè)與之性質(zhì)差別較大的Leu；④突變所改變的氨基酸位于ALDP功能區(qū)ATP結(jié)合區(qū)保守序列內(nèi)［5］；⑤1999年Takano等曾報(bào)道在緊鄰的第507位氨基酸發(fā)生的一個(gè)突變，即G507V［3］.該突變具體如何影響ALDP的結(jié)構(gòu)和功能，有待進(jìn)一步研究.

以往ALD基因的突變分析在技術(shù)上大多采用常規(guī)RTPCR方法：先合成cDNA，然后分段對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增［6］.我們將新開發(fā)的長鏈RTPCR技術(shù)引入ALD基因的突變分析中：先擴(kuò)增ALD基因mRNA編碼區(qū)全長，然后分段進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增.該技術(shù)途徑簡化了操作，提高了重復(fù)性，減少了引物數(shù).該技術(shù)途徑在本研究的成功應(yīng)用，將為今后其他患者的基因診斷帶來便利.

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