Ⅰ群禽腺病毒感染診斷技術：血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染間接ELISA診斷技術

Ⅰ群禽腺病毒感染診斷技術：血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染間接ELISA診斷技術范圍本標準規(guī)定了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測雞血清4型Ⅰ群禽腺病毒抗體的技術規(guī)范。本標準所規(guī)定間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）適用于雞血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染抗體的特異性檢驗。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質量控制規(guī)范動物檢疫術語和定義下列術語和定義適用于本文件。血清4型Ⅰ群禽腺病毒FowladenovirusgroupⅠSerotype4是引起雞心包積水-肝炎綜合征的病原，主要造成3周齡～5周齡雞突然死亡，并伴隨有心包積水和肝炎。一抗Primaryantibodies第一抗體就是能和特異性抗原特異性結合的蛋白。本標準的一抗為經(jīng)離心后分離后雞的血清待檢樣品。酶標二抗HRP-labeledsecondaryantibodies二抗是利用抗體是大分子的蛋白質具有抗原性的性質，去免疫異種動物，由異種動物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的針對于此抗體的免疫球蛋白，同時用辣根過氧化物酶進行標記的抗體。本標準中的酶標二抗為兔抗雞辣根過氧化物酶標記的IgG，其效價應在1:32以上。血清標準品SPF雞接種血清4型Ⅰ群禽腺病毒經(jīng)PCR檢測為陽性后，制備的血清為陽性血清；SPF雞的血清作為標準陰性血清，PCR檢測結果為陰性。實驗室要求環(huán)境實驗室符合GB19489和GB/T27401要求，實驗室必須為生物安全Ⅱ級（BSL-2級）及以上實驗室。生物樣品應嚴格控制對環(huán)境的污染，試驗結束后應將相關樣品（血液）收集高壓滅菌后，送有資質的醫(yī)用垃圾處理公司做最終處理。人員操作人員應接受實驗室生物安全、實驗室質量管理和血清學實驗室檢測技術培訓。熟悉生物樣品處理以及熟悉間接ELISA檢測結果的判斷方法。儀器設備臺式高速離心機（最大轉速為15000rpm）。酶標儀。微量移液器：最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL。聚苯乙烯板。水平振蕩器。恒溫培養(yǎng)箱。試劑或材料除另有規(guī)定外，所有生化試劑均為分析純，水符合GB/T6682規(guī)定的一級水。陽性血清，SPF雞接種血清4型I群禽腺病毒經(jīng)PCR檢測為陽性后，制備的血清。陰性血清，SPF雞血清，PCR檢測結果應為陰性。血清4型I群禽腺病毒抗原：經(jīng)濃縮純化滅活后的全病毒，濃度為4.68mg/mL。酶標二抗：兔抗雞辣根過氧化物酶標記的IgG，效價應在1:32以上。磷酸鹽緩沖液（PBS），見附錄A.1。包被液，見附錄A.2。洗滌液，見附錄A.3。樣品稀釋液（封閉液），見附錄A.4。底物溶液，TMB底物顯色液。終止液（濃度為2M），見附錄A.5。樣品樣品的準備與處理待檢禽血清樣品，每份不少于200μL，無溶血。用樣品稀釋液4.4.8將被檢血清樣品稀釋10倍（1:10，如10μL血清加入90μL稀釋液中）。注意：不要稀釋對照血清。確保每個樣品換一個吸頭，做好樣品的標記。稀釋的樣品血清充分混勻后，加入包被孔。樣品保存樣品應盡快處理。操作步驟將試驗試劑預溫到20℃～25℃。將全病毒抗原按照濃度為4.68μg/μL用1×碳酸鹽緩沖液（pH9.6）稀釋400倍，每孔100μL加入到96孔聚苯乙烯板中，37℃孵育2h后，繼續(xù)4℃孵育過夜。孵育后洗滌液洗5次，甩干板上殘余液體。每孔加入200μL封閉液，37℃溫箱孵育1h，用5.3.2方法洗板。在A1、A2孔各加100μL陰性血清對照，A3、A4孔各加100μL陽性血清對照。將100μL稀釋好的待檢血清加入其他各孔，混勻后，37℃孵育1h，用5.3.2方法洗板。酶標二抗用樣品稀釋液按1:1000倍稀釋，每孔加入100μL，37℃孵育1h，用5.3.2方法洗板。每孔加入100μLTMB顯色液，37℃避光條件下孵育15min。每孔加入50μL終止液，輕輕振蕩，終止反應。將酶標板置于酶標儀中，于450nm測定各孔樣品的吸光值（OD），該操作需在30min內(nèi)完成。結果判定陰性對照OD均值=（ODA1+ODA2）/2；陽性對照OD均值=（ODA3+ODA4）/2。陽性對照平均值減去陰性對照平均值，其差必須大于0.40；陰性對照平均值必須小于等于0.36，試驗條件成立，否則重復測定。陽性樣品OD450≥0.40，待檢血清為陽性，即已感染血清4型I群禽腺病毒。陰性樣品OD450＜0.36，待檢血清為陰性，即未感染血清4型I群禽腺病毒?？梢蓸悠?.36＜OD450＜0.40，判為可疑，重復測定。

（規(guī)范性附錄）

ELISA試驗用溶液的配制磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/LpH7.4）NaCl8.0gKCl0.2gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O0.2g水加至1000mL包被液（0.05mol/LpH9.6）Na2CO30.2