第五章花藥和花粉培養(yǎng)(共60張PPT)

第五章花藥和花粉培養(yǎng)本章主要內(nèi)容：花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù)花粉和花藥培養(yǎng)應(yīng)用本章教學(xué)目的與要求掌握花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的區(qū)別；了解花藥最佳接種時(shí)期；掌握花藥培養(yǎng)的大致過程；掌握花粉發(fā)育的四種途徑；掌握花粉培養(yǎng)的大致過程?；ǖ慕Y(jié)構(gòu)花藥的發(fā)育雄蕊原基花藥原始體表皮------破損孢原細(xì)胞初生壁細(xì)胞(3-多層)外層為藥室內(nèi)壁---纖維層中層(1-3層)---破壞內(nèi)層為絨氈層---解體花粉囊壁藥隔和維管束減數(shù)分裂四分體單核花粉粒造孢細(xì)胞花粉母細(xì)胞花粉粒的形成過程造孢細(xì)胞2n四分體n有絲分裂減數(shù)分裂花粉母細(xì)胞2n單核花粉粒n成熟花粉粒n（雄配子體）3-細(xì)胞花粉粒（三核花粉粒）精細(xì)胞n精細(xì)胞n2-細(xì)胞花粉粒（二核花粉粒）營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞n生殖細(xì)胞n雄配子體的發(fā)育營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞精子花粉粒即雄配子體2--細(xì)胞花粉粒3-細(xì)胞花粉粒花粉粒切片圖小穗發(fā)育順序小花發(fā)育順序

花藥柱頭（漿片，鱗片）

（花藥）（花粉）

（花粉粒）花粉和花藥的培養(yǎng)(pollenandantherculture)

是指花粉在培養(yǎng)基上改變其正常發(fā)育和機(jī)能，不經(jīng)受精而發(fā)生細(xì)胞分裂，由單個(gè)花粉粒發(fā)育成完整單倍體植株的技術(shù)。單倍體植物(haplobiont)

用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉發(fā)育成一個(gè)完整的植株。第一節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)一、基本概念花藥培養(yǎng)是將花粉發(fā)育至一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以形成花粉胚或愈傷組織進(jìn)而分化成植株的技術(shù)?；ǚ叟囵B(yǎng)：是將花粉從花藥中分離出來(lái)進(jìn)行離體培養(yǎng)的過程。油菜成熟花藥的結(jié)構(gòu)花粉囊花粉囊壁成熟花粉?；ㄋ幜芽趦烧叩墓餐c(diǎn)是利用花粉（小孢子）染色體數(shù)目的單倍性，培育單倍體植株，這是花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種的主要原因。單倍體植物3個(gè)明顯特點(diǎn)：

1、體細(xì)胞染色體數(shù)減半，2、生長(zhǎng)發(fā)育弱，體形小，3、雌雄配子嚴(yán)重不育。

1、外植體的選擇

外植體的遺傳背景、生理狀態(tài)和花粉發(fā)育時(shí)期。

選擇花粉發(fā)育適宜時(shí)期（一般是單核中晚期到雙核早期）的花蕾。

鏡檢花粉發(fā)育時(shí)期，并根據(jù)發(fā)育時(shí)期與花蕾大小、外觀形態(tài)和顏色等的相關(guān)性，選擇適宜的花蕾。二、花藥培養(yǎng)外部形態(tài)觀察：在水稻中，一般葉枕距為5-15cm，穎片淡黃綠色、雄蕊長(zhǎng)度接近穎片長(zhǎng)度的1/2時(shí)，可能為單核靠邊期的花粉。壓片染色法：是檢測(cè)花粉發(fā)育時(shí)期的簡(jiǎn)便有效方法，常用染色劑為醋酸洋紅?；ǚ郯l(fā)育時(shí)期的檢測(cè)：取花粉發(fā)育適宜的花蕾進(jìn)行預(yù)處理，低溫處理一般在3-5℃處理3-10d，高溫處理一般在35℃處理1-3d。為避免花蕾失水，可將花蕾置于內(nèi)裝有浸濕的濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行處理。2、材料預(yù)處理3、材料消毒消毒方法與其它組織消毒4、接種盡可能地避免花藥受到損傷；接種速度盡量快；注意接種密度。（1）基本培養(yǎng)基

因植物不同所用基本培養(yǎng)基不同，MS、N6、B5等。（2）蔗糖濃度

培養(yǎng)基中蔗糖濃度比其它組織培養(yǎng)高，尤其早期培養(yǎng)，一般5%—10%。原因是花粉母細(xì)胞的滲透壓比花絲等體細(xì)胞高，即高濃度的蔗糖不利于藥壁、花絲等體細(xì)胞的生長(zhǎng)，而利于花粉的生長(zhǎng)。

5、培養(yǎng)激素種類和濃度對(duì)花藥和花粉培養(yǎng)很重要。花藥壁分化程度高，重新分裂需要較高的激素濃度才能啟動(dòng)。因此，花藥培養(yǎng)基的激素水平要相對(duì)較低才能抑制二倍體細(xì)胞的分裂。確定適宜的激素濃度，以促使花粉細(xì)胞分裂的同時(shí)又抑制花藥二倍體細(xì)胞分裂是成功獲得單倍體的關(guān)鍵。（3）激素

固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)雙層培養(yǎng)花藥培養(yǎng)的目的是花藥內(nèi)花粉的植株再生，即單倍體再生。因此可將花藥培養(yǎng)數(shù)日后，取出其中花粉再培養(yǎng)。（4）培養(yǎng)方式花藥和花粉培養(yǎng)中，花粉有5種去向：敗育肥大花粉發(fā)芽花粉由不定芽形成花粉不定胚形成花粉6、植株再生再生植株途徑有2種：1、經(jīng)由成愈傷組織再生植株2、經(jīng)由胚狀體再生植株

花藥培養(yǎng)不經(jīng)愈傷組織直接產(chǎn)生胚狀體是最理想的方式，這樣可免去愈傷組織和生根階段。但多數(shù)情況是產(chǎn)生愈傷組織，這時(shí)要用提高細(xì)胞分裂素，降低生長(zhǎng)素甚至不用生長(zhǎng)素的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化產(chǎn)生芽。單倍體確定方法，可以鏡檢根尖染色體數(shù)，或根據(jù)氣孔周圍保衛(wèi)細(xì)胞的大小來(lái)確定。染色體加倍，用秋水仙素處理：①培養(yǎng)階段：培養(yǎng)基中加入50-250mg/L秋水仙素。②移栽后：用0.2%秋水仙素浸泡生長(zhǎng)點(diǎn)1-3d，或每日傍晚點(diǎn)滴生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)滴，進(jìn)行5-6d。

7、單倍體確定及染色體加倍水稻花藥培養(yǎng)過程旗葉鞘用70％酒精擦洗一遍剝?nèi)テ烊~鞘，取出稻穗10％漂白粉10min無(wú)菌水洗3次培養(yǎng)5天，花藥變褐，20天后花藥裂開，長(zhǎng)出淡黃色的花粉愈傷組織，先長(zhǎng)芽，后長(zhǎng)根，形成幼苗。用接種環(huán)接種到培養(yǎng)基上左手持穗，右手用鑷子取花藥，放無(wú)菌培養(yǎng)皿中花藥培養(yǎng)脫毒1974年日本：花藥培養(yǎng)可以脫除草莓病毒；花藥采取時(shí)期單核期：花蕾4-6mm，花藥1mm花藥誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+瓊脂7g/L增殖分化培養(yǎng)基MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+瓊脂7g/L生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+瓊脂7g/L草莓花藥愈傷組織,再生植株,花藥植株2）人工擠壓法:用玻璃棒搗碎花藥使花粉釋放。外層為藥室內(nèi)壁---纖維層旗葉鞘用70％酒精擦洗一遍消毒方法與其它組織消毒原因是花粉母細(xì)胞的滲透壓比花絲等體細(xì)胞高，即高濃度的蔗糖不利于藥壁、花絲等體細(xì)胞的生長(zhǎng)，而利于花粉的生長(zhǎng)。單核期：花蕾4-6mm，花藥1mmEarlystageembryos(7-10days)(B.6、獲得染色體異附加系和代換系內(nèi)層為絨氈層---解體Maturedihaploidplants內(nèi)層為絨氈層---解體單倍體植物(haplobiont)MS和H培養(yǎng)基：適合雙子葉植物花藥培養(yǎng)；適宜時(shí)期：?jiǎn)魏似冢绕涫菃魏酥?、晚?單核靠邊期)雄配子體的發(fā)育營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞精子三、花粉培養(yǎng)習(xí)慣上，把處于四分體到單核早期的花粉稱小孢子。進(jìn)入單核以后則稱為花粉。

花粉粒即雄配子體。2細(xì)胞花粉或3細(xì)胞花粉2--細(xì)胞花粉3--細(xì)胞花粉1、花粉培養(yǎng)過程取花蕾（鏡檢）預(yù)培養(yǎng)數(shù)天取花藥消毒分離花粉接種培養(yǎng)愈傷組織發(fā)生由于花粉包于花藥內(nèi)，必須將它們從花藥中分離、收集才能進(jìn)行培養(yǎng)。方法：1）花粉漂浮自然釋放法:將花藥接種于液體培養(yǎng)中，使花粉自然釋放。2）人工擠壓法:用玻璃棒搗碎花藥使花粉釋放。3）機(jī)械法:用磁力攪拌器打碎花藥釋放花粉。釋放的花粉?！猃埦W(wǎng)（孔徑20—60um）過濾，除去藥壁等組織→500-1000轉(zhuǎn)/分離心1-5分鐘，收集花粉。花粉分離收集：

一般以液體培養(yǎng)（花粉密度調(diào)至104-105/ml），形成愈傷組織或胚狀體后轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基。

直接培養(yǎng)：直接取新鮮花藥的花粉粒進(jìn)行培養(yǎng)的方法（培養(yǎng)基中可添加花藥提取液）。

預(yù)培養(yǎng)：將花藥先懸浮培養(yǎng)2-4天（50個(gè)花藥/5ml），再擠出花粉，經(jīng)離心洗滌純化后懸浮培養(yǎng)。

哺育培養(yǎng)：將在合適培養(yǎng)基上培養(yǎng)裂開的花藥作為哺育組織，將預(yù)培養(yǎng)的花粉接種在其中的方法。

2、培養(yǎng)方式：看護(hù)培養(yǎng)：將花藥水平放于固體培養(yǎng)基上，在其上覆蓋小圓形濾紙，在濾紙滴加0.5ml含10個(gè)花粉粒的懸浮液滴的培養(yǎng)方法。微室培養(yǎng)：將一滴花粉懸液滴在蓋玻片上，在翻過來(lái)放在凹穴載玻片上，蓋玻片四周用石蠟密封。雙層培養(yǎng)：固相和液相雙層培養(yǎng)。3、培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基激素種類和濃度蔗糖濃度（1）基本培養(yǎng)基：MS和H培養(yǎng)基：適合雙子葉植物花藥培養(yǎng)；B5培養(yǎng)基：適合豆科和十字花科花藥培養(yǎng)；N6培養(yǎng)基：適合禾谷類作物的花藥培養(yǎng)。

細(xì)胞分裂素可促進(jìn)胚狀體形成；生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)愈傷組織形成。細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值高時(shí)可誘導(dǎo)愈傷組織分化苗（2）激素種類和濃度較高濃度蔗糖可誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織；較低濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗。（3）蔗糖濃度相同點(diǎn)：胚狀體成苗途徑、愈傷組織再分化成苗途徑不同點(diǎn)：花粉培養(yǎng)：1、需進(jìn)行花粉的分離，特殊的花粉誘導(dǎo)培養(yǎng)2、培養(yǎng)方式

四、花粉培養(yǎng)成苗途徑與花藥培養(yǎng)比較:五、單倍體植株染色體加倍的方法（一）單倍體植物天然發(fā)生的途徑：孤雌生殖孤雄生殖無(wú)配子生殖（二）單倍體植株染色體加倍的方法1、自然加倍2、人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、處理愈傷組織和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹單倍體植株的頂芽、腋芽，可得到能結(jié)實(shí)的二倍體植株。3、愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)，可得到二倍體植株。第二節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用

----單倍體植株育種1、誘導(dǎo)形成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期；2、有利于篩選隱性突變體，提高選擇效率;3、有利于隱性基因控制性狀的選擇4、快速獲得自交系的超雄株5、遺傳工程受體6、獲得染色體異附加系和代換系7、突變體選育大大縮短育種周期Canola(Brassicanapus).

Dihaploidplantsweregeneratedwithhigholeicandreduced

linoleicandα-linolenicacidsintheseedoilandfieldtested

forstabilityofthefattyacidsandyield.

Uninucleatemicrosporesinsuspension

(Brassicanapus)Earlystageembryos(7-10days)(B.napus)Mid-stageEmbryos(10-14days)(B.napus)Latestageembryos(21days)(B.napus)Latestagecotyledonaryembryos(B.napus)Dihaploidplantsweregeneratedwithhigholeicandreduced

linoleicandα-linolenicacidsintheseedoilandfieldtested

forstabilityofthefattyacidsandyield.旗葉鞘用70％酒精擦洗一遍因此可將花藥培養(yǎng)數(shù)日后，取出其中花粉再培養(yǎng)。原因是花粉母細(xì)胞的滲透壓比花絲等體細(xì)胞高，即高濃度的蔗糖不利于藥壁、花絲等體細(xì)胞的生長(zhǎng)，而利于花粉的生長(zhǎng)。（二）單倍體植株染色體加倍的方法培養(yǎng)基中蔗糖濃度比其它組織培養(yǎng)高，尤其早期培養(yǎng)，一般5%—10%。釋放的花粉粒→尼龍網(wǎng)（孔徑20—60um）過濾，除去藥壁等組織→500-1000轉(zhuǎn)/分離心1-5分鐘，收集花粉。內(nèi)層為絨氈層---解體花藥培養(yǎng)是將花粉發(fā)育至一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以形成花粉胚或愈傷組織進(jìn)而分化成植株的技術(shù)。左手持穗，右手用鑷子取花藥，放無(wú)菌培養(yǎng)皿中單倍體確定方法，可以鏡檢根尖染色體數(shù)，或根據(jù)氣孔周圍保衛(wèi)細(xì)胞的大小來(lái)確定。花粉和花藥的培養(yǎng)(pollenandantherculture)花藥培養(yǎng)的目的是花藥內(nèi)花粉的植株再生，即單倍體再生?；ㄋ幣囵B(yǎng)是將花粉發(fā)育至一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以形成花粉胚或愈傷組織進(jìn)而分化成植株的技術(shù)。MS和H培養(yǎng)基：適合雙子葉植物花藥培養(yǎng)；花藥培養(yǎng)的目的是花藥內(nèi)花粉的植株再生，即單倍體再生?！癎ermination”CotyledonaryembryostransferredtolightgrowthconditionswithGA3(B.napus)Growthofhaploidseedlingsonsolidculturemedium(B.napus)Well-developedhaploidplantletreadyfortransfertos