保加利亞乳桿菌

保加利亞乳桿菌第一頁，共十三頁，編輯于2023年，星期六課題現(xiàn)提供一瓶酸奶（光明益生菌發(fā)酵乳），內(nèi)有保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌，嗜酸乳桿菌，兩歧雙歧桿菌、干酪乳桿菌?，F(xiàn)分離出保加利亞乳桿菌，并制成斜面冰箱保存第二頁，共十三頁，編輯于2023年，星期六保加利亞乳桿菌形態(tài)：菌體長約2-9um,寬約0.5-0.8um,呈單個體長桿狀,不具運動性,也不會產(chǎn)生孢子。培養(yǎng)特性：在牛奶上培養(yǎng),菌落為無色到淡白色,通常呈不光滑狀,直徑1-3mm左右。生長需維生素B3和煙堿酸的幫助培養(yǎng)：氧氣需求方面,此菌為厭氧性,但在有氧狀況下也可作用;酸堿度方面,為耐酸或嗜酸性,因低pH能防止一些微生物的生長;溫度方面,為嗜溫至少許嗜熱,最適生長溫度在37-45℃之間,對低溫非常敏感。能發(fā)酵的醣類有l(wèi)actose（乳糖）,glucose葡萄糖）,fructose（果糖）,mannose（甘露糖）,sorbitol（山梨糖醇）等。第三頁，共十三頁，編輯于2023年，星期六利用MRS瓊脂培養(yǎng)基對保加利亞乳桿菌進行分離,分別挑取可疑菌落進行革蘭氏染色,對鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽性菌,且細菌形狀為桿狀的菌種進行糖發(fā)酵試驗生物化學鑒定.結(jié)論:在MRS瓊脂培養(yǎng)基上,菌落較大、透明、灰白色,鏡檢細菌形狀為桿狀,麥芽糖和七葉苷發(fā)酵試驗均為陰性,乳糖發(fā)酵陽性的菌種,即為保加利亞乳桿菌.實驗設計原理第四頁，共十三頁，編輯于2023年，星期六試驗流程檢樣25ml樣品+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2~3個適宜稀釋度的樣品菌液,各取1ml分別涂布MRS瓊脂培養(yǎng)基上平板置于37℃﹑CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2~3天選取50~300個菌落的稀釋度,挑取可疑菌落的一半進行革蘭氏染色另一半接種于乳清瓊脂培養(yǎng)基,準備做生化鑒定將疑似菌落穿刺接種于五種糖發(fā)酵半固體瓊脂培養(yǎng)基(麥芽糖、七葉苷、乳糖蔗糖、葡萄糖)平板置于37℃﹑CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2~3天判斷、制斜面、冰箱保存可疑菌落:菌落較大，透明，灰白色的為疑似菌落第五頁，共十三頁，編輯于2023年，星期六1.1材料與設備原料：酸奶、MRS瓊脂培養(yǎng)基、乳清培養(yǎng)基、乳清、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、化學試劑均為分析純或生化試劑胰蛋白膏、酵母膏、酵母提取物、魚肉蛋白胨、生化鑒定糖類（麥芽糖、七葉苷、乳糖、蔗糖、葡萄糖）設備及儀器：超凈工作臺、高壓滅菌鍋、CO2培養(yǎng)箱、顯微鏡、培養(yǎng)皿、燒杯、電爐、試管、搪瓷杯、酒精燈、吸量管、試管架、電子天平、pH試紙、玻璃棒、恒溫水浴箱、冰箱、接種環(huán)、接種針、量筒﹑紗布﹑脫脂棉等第六頁，共十三頁，編輯于2023年，星期六1.2培養(yǎng)基的配置MRS瓊脂培養(yǎng)基的制備

配方：葡萄糖20ｇ、胰蛋白胨10ｇ、牛肉膏10ｇ、酵母提取物5ｇ、檸檬酸二銨2ｇ、磷酸二氫鉀2ｇ、MgSO4?7H2O0.58ｇ、MnSO4?4H2O0.25ｇ、吐溫80為1ml、蒸餾水1L、瓊脂20ｇ制法：將MgSO4?7H2O、MnSO4?4H2O﹑葡萄糖以及吐溫80以外的各成分溶解、冷卻至50℃，以醋酸調(diào)節(jié)pH值為6.0~6.5而后加入MgSO4?7H2O、MnSO4?4H2O，最后加葡萄糖和吐溫80，在121℃高溫滅菌20min第七頁，共十三頁，編輯于2023年，星期六2.乳清培養(yǎng)基的制備配方：乳清500ml;蒸餾水500ml；胰蛋白胨5g；葡萄糖1g；酵母膏2.5g；瓊脂粉20g；pH值為6.5.制法：將上述各成分加熱溶解于乳清中，調(diào)整pH為6.5，加入瓊脂，加熱溶解，115℃，高壓滅菌20min，傾注平板3.乳清的制備

稱取乳清粉100g加入90℃的1L蒸餾水中溶解（先將水加熱，而后加入乳清粉，以防糊底)。去6~8ml濃度為1mol/L的HCl倒入上述1L乳清粉液中，調(diào)節(jié)pH值至4.5左右（最好一次調(diào)成），保持90℃﹑30min，使酪蛋白大量析出，凝結(jié)成塊。用脫脂棉和紗布過濾出乳清，將乳清用濃度為1mol/L的NaCl調(diào)回pH值至6.5，而后煮沸，再用濾紙過濾，流通蒸汽滅菌30min備用。第八頁，共十三頁，編輯于2023年，星期六4.糖發(fā)酵培養(yǎng)基的制備配方：魚肉蛋白胨5g，酵母提取物5g，胰蛋白胨5g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，MgSO4,·7H2O為0.2g，MnSO4,·4H2O為0.2g，CaCO33g，吐溫80為1ml，蒸餾水1L，質(zhì)量分數(shù)為1.6％溴甲酚紫，瓊脂粉5g，麥芽糖（七葉苷、乳糖、蔗糖、葡萄糖）10g。制法：將MgSO4,·7H2O，MnSO4,·4H2O，麥芽糖（七葉苷、乳糖、蔗糖、葡萄糖），吐溫80以外的各成分溶解，冷去至50℃，以醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.2~6.4，在121℃高壓蒸汽滅菌20min第九頁，共十三頁，編輯于2023年，星期六①取酸奶25ml，放入無菌三角瓶中，加入無菌生理鹽水225ml，充分溶解混勻。②從試管中取出1ml菌液，于另一試管中，再加入9ml無菌生理鹽水。③如此稀釋四次。5個試管分別按順序記為1,2,3,4,5。④分別從5個試管中取出0.05ml菌液涂布于MRS瓊脂平板，稀釋菌液置于4℃冰箱備用，⑤平板置于37℃，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3d。⑥挑取可疑菌落的一半進行革蘭氏染色。⑦另一半分純種接種于乳清瓊脂培養(yǎng)基，準備做生化鑒定⑧取麥芽糖、七葉苷、乳糖、蔗糖和葡萄糖五種糖發(fā)酵半固體培養(yǎng)基，分裝試管，高度約為4~5㎝。⑨用接種環(huán)以無菌操作從純培養(yǎng)于乳清瓊脂培養(yǎng)基的疑似菌種穿刺接種。⑩置于37℃下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3d挑取純種的保加利亞桿菌于含有培養(yǎng)基的試管中，并制做成斜面發(fā)在適當?shù)臈l件下進行保藏·。實驗步驟第十頁，共十三頁，編輯于2023年，星期六試驗中使用了5個菌液稀釋度（102,103,104,105,106）進行涂布，目的是為了確定哪個稀釋度最適宜。一般在培養(yǎng)基上長出50~300個菌落的稀釋度為最佳。生化鑒定的結(jié)果是：乳糖發(fā)酵試管中培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色者，其余4種糖發(fā)酵培養(yǎng)基均未變色的菌落。生化鑒定結(jié)果第十一頁，共十三頁，編輯于2023年，星期六3結(jié)論將實驗結(jié)果與鑒定流程和生化特性對照，可以得出：利用MRS培養(yǎng)基分離出的菌種，表現(xiàn)為菌落較大、透明、灰白色，鏡檢細菌形狀為桿狀，麥芽糖和七葉苷發(fā)酵試驗均為陰性。乳糖發(fā)酵為陽性的菌種，即為保加利亞乳桿菌第十二頁，共十三頁，編輯于2023年，星期六實驗用品的依據(jù)MRS瓊脂培養(yǎng)基的選擇:當乳酸菌生長代謝出乳酸后，會使pH下降而使顏色由綠變?yōu)辄S綠，也由于pH值降低再加上抗生素及厭氧培養(yǎng)的作用，所以一般的微生物不容易在此培養(yǎng)基上生長，因此十分容易鑒別