免疫抑制劑對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響

免疫抑制劑對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響【摘要】目的研究免疫抑制劑對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(Macrophage，M)的損傷作用機(jī)制。方法以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為對象，采用小鼠尾靜脈注射地塞米松/只，環(huán)磷酰胺/只，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)，檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及腹腔灌洗液中NO2-/NO3-濃度并用形態(tài)學(xué)方法觀察比較免疫抑制劑對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的損傷特點(diǎn)。結(jié)果地塞米松和環(huán)磷酰胺均能抑制巨噬細(xì)胞功能，與對照組比，細(xì)胞吞噬功能均顯著下降，DEX組腹腔灌洗液中NO2-/NO3-濃度顯著升高，Cy組不升高。VitC為自由基鏈反應(yīng)阻斷劑，阻斷過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可減輕損傷，可使DEX組細(xì)胞吞噬功能獲得部分恢復(fù)。結(jié)論推測環(huán)磷酰胺對腹腔巨噬細(xì)胞損傷是以直接損傷染色體而DEX以氧化損傷為主。

【關(guān)鍵詞】地塞米松環(huán)磷酰胺巨噬細(xì)胞

Theeffectofdexamethasoneandcyclphosphamideonperitonealmacrophageofmice

【Abstract】ObjectiveWeinvestigateddemagemechanismofperitonealmacrophage(M)inducedbyinjectionofdexamethasoneandcyclophosphamideinTheimmunefunctionbydeterminingthephagocyticfunctionandstructureofthemacrophagocytesoftheabdominalcavitiesofmiceinvitro.Thephagocytosisofperitonealmacrophageswasevaluatedbychickenerythrocytesmethod;ObservedtheconcentratuonofNO-2/NO-3intheperitoneallavageDexamethasoneandcyclophosphamideinducedtheapoptosisofperitonealmacrophageandconcomitantdecreaseofphagocytosis(vscontrolgroup，)，theconcentratuonofNO-2/NO-3intheperitoneallavagefluidsignificantlyincreasedafterdexamethasoneinjection;VitC(inhibitorofiNOSandinhibitorofreactiveoxygenspecies)preventedtheapoptosisofperitonealmacrophageandreducedtheconcentrationofNO-2/NO-3intheperitoneallavagefluidaftertheeffectofTheseevidencessupportthatNOandactiveoxygenspeciesmaybeinvolvedintheapoptosisprocessofperitonealperitonealmacrophageinducedbydexamethasoneinmice.

【Keywords】dexamethasonecyclophosphamidemacrophage

地塞米松和環(huán)磷酰胺在臨床腫瘤的治療中是常用的藥物，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)又會引起免疫系統(tǒng)損傷，而影響治療效果。巨噬細(xì)胞(macrophage，M)是機(jī)體免疫體系中重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有非特異性直接清除各種異物，殺傷病原體和腫瘤細(xì)胞的功能，并具有抗原提呈作用。本實(shí)驗(yàn)選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)一步探討在整體條件下地塞米松和環(huán)磷酰胺對免疫功能影響的機(jī)制。

1材料和方法

實(shí)驗(yàn)分組及動物處理昆明種雄性小鼠，日齡55～58天。60只分為5組：正常對照組；DEX組：腹腔注射地塞米松150μg/只，每日1次，連續(xù)注射3次；Cy組：腹腔注射環(huán)磷酰胺/只，每日1次，連續(xù)注射3次；VitC+DEX組：與DEX組同時(shí)注射；VitC+Cy組：與Cy同時(shí)注射；給藥第2天上述小鼠腹腔注射2%無菌淀粉1ml。

腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定于第4天取各組6只，小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞1ml，30min后，引頸處死小鼠，腹腔注射D-HanKs1ml，輕輕按揉腹壁1min，吸出腹腔液滴片。置37°C濕盒孵育30min后，用PBS沖洗，去除未貼壁M和游離雞紅細(xì)胞，1：1丙酮-甲醇固定7～8min，自然晾干。有姬母薩-瑞士染液進(jìn)行染色，油鏡下計(jì)數(shù)M和M吞噬CRBC數(shù)。用下列公式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)：吞噬百分率=吞噬雞紅細(xì)胞的M/100個(gè)M×100%吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/100個(gè)M。

細(xì)胞涂片Giemsa染色各組小鼠第4天引頸處死，腹腔注射D-Hanks液5ml，吸出腹腔液4℃500r/min，去上清與PBS制成細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞為1×106個(gè)/ml，100μl涂片，涼干后甲醇固定，晾干Giemsa染色，普通光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

腹腔巨噬細(xì)胞NO檢測NO2-/NO3-的測定按NO試劑盒說明書操作，最后測定500nm吸光度值。NO2-/NO-3=/。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并采用Student-NK檢驗(yàn)法進(jìn)一步檢驗(yàn)。腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定結(jié)果見表1。DEX和Cy注射組小鼠M的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均明顯降低，與生理鹽水對照組比較具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;VitC+DEX組M的吞噬百分率和吞噬指數(shù)比DEX組有顯著提高；VitC+Cy組M的吞噬百分率和吞噬指數(shù)較Cy組差異無顯著性。形態(tài)學(xué)變化可見：DEX組和Cy組較對照組出現(xiàn)明顯形態(tài)變化細(xì)胞變小，染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞質(zhì)濃縮，可見凋亡小體。

腹腔巨噬細(xì)胞NO檢測結(jié)果見圖1：小鼠腹腔灌洗液中NO濃度測定顯示：與對照組比，DEX組NO2-/NO-3濃度顯著上升，而VitC能部分逆轉(zhuǎn)NO濃度，但對Cy組無明顯改善。表1腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定結(jié)果

注：①與對照組比較，;②與對照組比較，;③與DEX組比較，；④與Cy組比較，

圖1腹腔巨噬細(xì)胞NO檢測結(jié)果注：①與對照組比較，P＜;②與DEX組比較，P＜，③與DEX組比較，P＜;④與Cy組比較，P＞

3討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫體系中重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)選用腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的方法來觀察免疫抑制劑對巨噬細(xì)胞的影響。結(jié)果可見，免疫抑制劑可顯著抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力；VitC能明顯改善地塞米松對巨噬細(xì)胞的影響。文獻(xiàn)報(bào)道抗氧化劑VitC通過清除氧自由基和降低脂質(zhì)過氧化提高機(jī)體免疫功能［1～3］。機(jī)體氧化-抗氧化的平衡對維持正常的免疫功能具有重要的作用，它影響到免疫細(xì)胞膜磷脂、細(xì)胞內(nèi)蛋白、核酸的完整性和免疫信號的傳導(dǎo)及基因表達(dá)。免疫細(xì)胞由于其細(xì)胞膜磷脂含有較高的不飽和脂肪酸，因此對氧應(yīng)激非常敏感［4］。已有實(shí)驗(yàn)證明VitC有很強(qiáng)的抗氧化作用，注射VitC可明顯減弱DEX對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的抑制作用，分析DEX對巨噬細(xì)胞的免疫抑制作用可能與其氧化損傷有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道［5］抗氧化劑維生素C通過抑制DEX誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖能力，VitC具有抗氧化作用，提示通過抗氧化促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制DEX誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的凋亡。巨噬細(xì)胞具有非特異性直接清除各種異物，殺傷病原體和腫瘤細(xì)胞的功能［6］。靜止的巨噬細(xì)胞胞體小，細(xì)胞活性低，吞噬功能弱。當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活后，細(xì)胞胞體變大、表面突起增多，細(xì)胞內(nèi)有完整的細(xì)胞器，且溶酶體、線粒體增多，細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VitC改善巨噬細(xì)胞吞噬功能，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，VitC處理的M細(xì)胞表面突起增多，細(xì)胞伸展率提高并能對抗DEX引起的細(xì)胞變小，伸展性差，細(xì)胞聚集成團(tuán)現(xiàn)象。有研究報(bào)道DEX可降低M的吞噬作用［7，8］，Grasso等［9］研究發(fā)現(xiàn)DEX與M體外共同孵育可抑制M細(xì)胞吞噬功能，但培養(yǎng)液中一旦去除DEX，M吞噬功能很快便得到恢復(fù)。DEX具有誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡的作用［10］。M凋亡的機(jī)制十分復(fù)雜，近年的研究發(fā)現(xiàn)許多因素與M凋亡有關(guān)。巨噬細(xì)胞受到刺激或進(jìn)行吞噬作用后，發(fā)生呼吸暴發(fā)，可產(chǎn)生大量的活性氧及NO等活性物質(zhì)［11］。是巨噬細(xì)胞在腫瘤免疫中發(fā)揮獨(dú)特作用的基礎(chǔ)，一定濃度的NO又是M凋亡信息傳遞通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過調(diào)控巨噬細(xì)胞自身凋亡保持巨噬細(xì)胞數(shù)量恒定［12］。有研究報(bào)道凋亡時(shí)活性氧和NO或減少或增多［13］，機(jī)制尚不清。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示DEX誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡與NO生成增多有關(guān)。NO是一種自由基氣體，其不成對電子在氮原子上，為氮自由基參與細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，VitC為自由基鏈反應(yīng)阻斷劑，減輕損傷，能部分抑制巨噬細(xì)胞凋亡，細(xì)胞吞噬機(jī)能也獲得部分恢復(fù)，以DEX組較顯著。本實(shí)驗(yàn)提示VitC以抗氧化與抑制DEX誘導(dǎo)的M凋亡有關(guān)。推測環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞凋亡是以直接損傷染色體而DEX以氧化損傷為主，VitC以抗氧化作用而減輕DEX誘導(dǎo)的M凋亡?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】

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