動物源食品安全現(xiàn)狀及快速檢測技術(shù)研究進展概述

動物源食品安全現(xiàn)狀及快速檢測技術(shù)研究進展中國農(nóng)業(yè)大學沈建忠2010年11月當前第1頁\共有100頁\編于星期四\20點主要內(nèi)容一、畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及動物源產(chǎn)品簡況二、動物源食品安全現(xiàn)狀三、食品安全監(jiān)控相關(guān)法律法規(guī)四、有害化合物殘留檢測技術(shù)五、快速檢測產(chǎn)品研制六、展望當前第2頁\共有100頁\編于星期四\20點

中國是養(yǎng)殖業(yè)大國，其中：豬，60960萬頭奶牛，1300萬頭禽，120億羽羊，28564.7萬只一、畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及動物源產(chǎn)品簡況當前第3頁\共有100頁\編于星期四\20點

中國又是動物源產(chǎn)品生產(chǎn)和消費大國，其中：肉類，7300萬噸，人均達56kg；蛋類，2650萬噸，人均達20kg；奶類，3650萬噸，人均達28kg；水產(chǎn)品，4900萬噸，人均達38kg。當前第4頁\共有100頁\編于星期四\20點二、動物源食品安全現(xiàn)狀全球經(jīng)濟一體化和食品貿(mào)易國際化使食品安全成為一個世界性的挑戰(zhàn)和全球重要的公共衛(wèi)生問題。其中外源化合物（獸藥、藥物添加劑、違禁藥物等）殘留超過最高殘留限量標準以及臨床使用不遵守休藥期是影響動物源食品安全的最主要因素之一。盡管世界各國采取了一系列政策和監(jiān)控措施，但世界范圍內(nèi)涉及食品安全的惡性、突發(fā)事件時有發(fā)生，食品安全現(xiàn)狀仍然令人擔擾。我國目前食品檢測數(shù)量僅占食品生產(chǎn)總量的1.5%，且大多數(shù)為出口食品，國內(nèi)消費食品檢測比率極低。當前第5頁\共有100頁\編于星期四\20點1、國外動物源食品安全事件

—1972年墨西哥抗氯霉素傷寒桿菌1400人死亡

—上世紀70年代意大利波多黎各玉米赤霉醇污染牛奶上千兒童性早熟

—1995年日本O157:H7

涉及44個都府縣上萬人中毒死亡11人

—1996年英國瘋牛病損失300億美元

—1999年比利時二惡英1000萬只雞被屠宰損失3.55億歐元

—1999年美國法國李斯特桿菌20人死

—2000年日本大阪牛奶金黃色葡萄球菌14500人腹瀉等80人住院強制召回

當前第6頁\共有100頁\編于星期四\20點—2001年英國口蹄疫迅速入侵歐洲大陸和南美洲—2003年歐洲甲孕酮污染豬飼料—2005年英國蘇丹紅事件—2006年美國毒菠菜事件大腸桿菌污染造成26個州200余人感染，其中3人死—2008年日本水銀大米水銀污染田種植水稻出售—2009年美國花生醬事件花生醬和花生糊被沙門氏菌污染，造成636人感染，至少9人死亡?！?009年加拿大李斯特桿菌事件1人死當前第7頁\共有100頁\編于星期四\20點2、國內(nèi)動物源食品安全事件—1987年上海毛蚶甲肝30萬市民感染—1997年香港禽流感事件—1998江西食用裝過有機錫油桶中的豬油200多人中毒3人死亡—1999年8月至2000年1月化學物或微生物污染出口到美國的634批食品遭銷毀—農(nóng)畜產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標2001年24個?。ㄊ校?、自治區(qū)調(diào)查食品中農(nóng)藥殘留超標率高達18.5%—2001年蘇皖等省腸出血性大腸桿菌O157:H7污染食物引起2萬余人中毒177人死亡當前第8頁\共有100頁\編于星期四\20點—2002年廣西柳州市78人食用有機磷農(nóng)藥超標菜花中毒事件—上世紀90年代畜產(chǎn)品和水產(chǎn)品出口歐盟、日本等屢屢受阻—2002年SARS食用野生動物（動物產(chǎn)品）—“瘦肉精”殘留事件常年發(fā)生上萬人中毒—2003年廣西等地豬肉氯霉素殘留事件—2003年山東禽肉查出含呋嗎唑酮和呋喃唑酮殘留出口瑞典的遭封殺—2005年以來禽流感—2005年出口香港水產(chǎn)孔雀石綠當前第9頁\共有100頁\編于星期四\20點—2006年上海多寶魚事件和河北紅心鴨蛋事件—2007年山東多寶魚事件—2008年出口日本禽產(chǎn)品硝基呋喃代謝物殘留事件—2008年三鹿奶粉事件—2009年2月浙江多省63名嬰兒多美滋嬰兒配方奶粉腎結(jié)石—2009年4月浙江晨園乳業(yè)皮革水解蛋白—2009年12月上海熊貓乳品有限公司因三聚氰胺超標被查處—2010年1月貴州發(fā)現(xiàn)山東淄博綠賽爾乳業(yè)有限公司、遼寧省鐵嶺五洲食品有限公司和河北唐山樂亭縣凱達冷凍廠生產(chǎn)的奶制品含有過量的三聚氰胺當前第10頁\共有100頁\編于星期四\20點從1997年至2007年，中國農(nóng)產(chǎn)品外貿(mào)因食品安全綠色（技術(shù)）壁壘而受阻的產(chǎn)品總值超過2000億美元；1997年香港禽流感，內(nèi)地損失2億多元，香港損失5000多萬元；2002年出口歐盟水產(chǎn)品因氯霉素殘留事件遭全面禁運造成損失6億多美元；2004年山東出口禽肉因磺胺二甲嘧啶殘留超標造成損失1.3億元；2007年山東多寶魚事件損失40億元。2008年三聚氰胺損失……?當前第11頁\共有100頁\編于星期四\20點

細菌（如沙門氏菌、彎曲菌、李氏桿菌等）病毒（如禽流感等）寄生蟲（如旋毛蟲等）

化學污染

獸藥殘留（包括允許使用和禁用品種）農(nóng)藥殘留（有機磷、有機氯等）環(huán)境污染物（如多氯聯(lián)苯等）重金屬（如鉛、鎘等）霉菌毒素（如玉米赤霉醇等）非法添加物（如三聚氰胺、皮革水解蛋白等）包裝材料

生物污染

在養(yǎng)殖源頭（如飼料、飼養(yǎng)環(huán)境）、飼養(yǎng)過程及產(chǎn)品運輸、加工過程中出現(xiàn)：3、產(chǎn)生動物源食品安全問題的主要原因當前第12頁\共有100頁\編于星期四\20點豬及其產(chǎn)品殘留主要品種β-興奮劑類，如克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等鎮(zhèn)靜藥物類氯霉素喹諾酮類，如恩諾沙星、環(huán)丙沙星等磺胺類，如磺胺二甲嘧啶等四環(huán)素類，如土霉素、金霉素等……當前第13頁\共有100頁\編于星期四\20點雞及其產(chǎn)品殘留主要品種硝基呋喃類，如呋喃唑酮、呋喃它酮等氯霉素喹諾酮類，如恩諾沙星、環(huán)丙沙星等磺胺類，如磺胺二甲嘧啶等四環(huán)素類，如土霉素、金霉素等激素類?……當前第14頁\共有100頁\編于星期四\20點肉牛及其產(chǎn)品殘留主要品種β-興奮劑類，如克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等玉米赤霉醇類喹諾酮類，如恩諾沙星、環(huán)丙沙星等……當前第15頁\共有100頁\編于星期四\20點奶牛及奶制品殘留主要品種三聚氰胺、β-內(nèi)酰胺酶霉菌毒素β-內(nèi)酰胺類（青霉素類和頭孢類），如青霉素、阿莫西林、氨芐西林、氯唑西林、頭孢喹肟、頭孢噻呋等β-興奮劑類，如克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等喹諾酮類，如恩諾沙星、環(huán)丙沙星等氨基糖苷類，如鏈霉素、慶大霉素等磺胺類，如磺胺二甲嘧啶等四環(huán)素類，如四環(huán)素、土霉素、金霉素等氯霉素激素類?……當前第16頁\共有100頁\編于星期四\20點4、殘留危害對人類健康的直接危害中毒、過敏、激素樣作用、腸道菌群紊亂等對人類健康的間接危害動物源耐藥病原菌沿食物鏈的傳遞、擴散對動物疾病防治的影響動物病原菌耐藥性上升對環(huán)境的影響土壤中的蠕蟲、微生物；水環(huán)境中的藻類、微生物當前第17頁\共有100頁\編于星期四\20點三、食品安全監(jiān)控相關(guān)法律法規(guī)《中華人民共和國動物及動物源食品中殘留物質(zhì)監(jiān)控計劃》《官方取樣程序》《獸藥管理條例》《飼料和飼料添加劑管理條例》《動物源食品中獸藥最高殘留限量》《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》《食品動物中禁止使用的化合物清單》

中國從1999年開始殘留監(jiān)控工作，先后發(fā)布以下法律法規(guī)：《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》《國家獸藥殘留基準實驗室藥物殘留檢測范圍》《獸藥停藥期規(guī)定》《中華人民共和國獸藥典》《中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》《中華人民共和國食品安全法》當前第18頁\共有100頁\編于星期四\20點農(nóng)業(yè)部235號公告中頒布了109種獸藥的限量標準，涉及馬、牛、羊、豬、禽、蜜蜂、魚、蝦等動物。樣品有組織（肌肉、肝臟、腎臟、脂肪等）、牛奶、蜂蜜等。農(nóng)業(yè)部193號公告頒布了21種食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單。當前第19頁\共有100頁\編于星期四\20點藥物名稱中國ppm美國ppm日本ppm歐盟ppm澳大利亞ppm新西蘭ppm食品法典委員會ppm加拿大ppm氰甲頭孢菌素///0.125////頭孢氨芐0.1/0.10.1////頭孢吡啉//0.030.06////頭孢呋肟////0.1///頭孢呱酮//0.050.05////頭孢喹啉0.02//0.02/0.03//頭孢喹咪//0.02/////頭孢洛啉////0.02///牛奶及奶制品中獸藥殘留限量當前第20頁\共有100頁\編于星期四\20點藥物名稱中國ppm美國ppm日本ppm歐盟ppm澳大利亞ppm新西蘭ppm食品法典委員會ppm加拿大ppm頭孢洛寧//0.010.02////頭孢匹林/0.02//0.010.01/0.02頭孢噻呋0.10.1/0.10.10.10.10.1頭孢唑啉///0.05////雙氫鏈霉素0.2//0.20.2///雙氫鏈霉素/鏈霉素//0.2//0.20.2/卡那霉素//0.40.1////慶大霉素0.2/0.20.1//0.2/新霉素0.50.150.5/0.50.51.5/鏈霉素0.2//0.2////當前第21頁\共有100頁\編于星期四\20點藥物名稱中國ppm美國ppm日本ppm歐盟ppm澳大利亞ppm新西蘭ppm食品法典委員會ppm加拿大ppm達氟沙星0.03/0.050.03////恩諾沙星0.1/0.050.1////氟甲喹//0.1/////麻保沙星//0.0750.075/0.075//阿莫西林//0.008/////阿撲西林//0.05/////氨芐青霉素0.010.010.020.0040.01///苯唑青霉素0.03/0.030.03////芐青霉素0.004/0.0040.004//0.004/當前第22頁\共有100頁\編于星期四\20點藥物名稱中國ppm美國ppm日本ppm歐盟ppm澳大利亞ppm新西蘭ppm食品法典委員會ppm加拿大ppm鄰氯青霉素0.030.010.020.030.01///美西林//0.05/////奈夫西林//0.005/////普魯卡因青霉素0.004///0.002///青霉素////0.0015//0.01I.U./ml雙氯青霉素//0.010.3////四環(huán)素0.1///0.10.1//阿維菌素////0.02///伊維菌素0.01/0.01/0.050.010.01/莫能菌素//0.01/0.01///當前第23頁\共有100頁\編于星期四\20點藥物名稱中國ppm美國ppm日本ppm歐盟ppm澳大利亞ppm新西蘭ppm食品法典委員會ppm加拿大ppm磺胺類0.1/0.010.1////磺胺吡啶//0.01/////磺胺二甲嘧啶0.025/0.025///0.0250.01磺胺胍//0.01/////磺胺間二甲氧嘧啶/0.010.02////0.01磺胺喹噁啉//0.01/////磺胺嘧啶//0.07/0.1///磺胺噻唑//0.09/////磺胺溴甲嘧啶鈉//0.01/////磺胺乙氧噠嗪/不得檢出//////磺胺乙氧嗪//0.01/////乙?；前?/0.01/////周效磺胺//0.06/0.1///當前第24頁\共有100頁\編于星期四\20點農(nóng)業(yè)部193號《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》序號獸藥及其它化合物名稱禁止用途禁用動物1β-興奮劑類：克侖特羅、沙丁胺醇、西馬特羅及其鹽、酯及制劑所有用途所有食品動物2性激素類：己烯雌酚及其鹽、酯及制劑所有用途所有食品動物3具有雌激素樣作用的物質(zhì)：玉米赤霉醇、去甲雄三烯醇酮、醋酸甲孕酮及制劑所有用途所有食品動物4氯霉素、及其鹽、酯（包括：琥珀氯霉素）及其制劑所有用途所有食品動物5氨苯砜及制劑所有用途所有食品動物6硝基呋喃類：呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃苯烯酸鈉及制劑所有用途所有食品動物7硝基化合物：硝基酚鈉、硝呋烯腙及制劑所有用途所有食品動物8催眠、鎮(zhèn)靜類：安眠酮及制劑所有用途所有食品動物9林丹（丙體六六六）殺蟲劑所有食品動物10毒殺芬（氯化烯）殺蟲劑、清塘劑所有食品動物當前第25頁\共有100頁\編于星期四\20點序號獸藥及其它化合物名稱禁止用途禁用動物11呋喃丹（克百威）殺蟲劑所有食品動物12殺蟲脒（克死螨）殺蟲劑所有食品動物13雙甲脒殺蟲劑水生食品動物14酒石酸銻鉀殺蟲劑所有食品動物15錐蟲胂胺殺蟲劑所有食品動物16孔雀石綠抗菌劑、殺蟲劑所有食品動物17五氯酚酸鈉殺螺劑所有食品動物18各種汞制劑包括：氯化亞汞（甘汞）、硝酸亞汞、醋酸汞、吡啶基醋酸汞殺蟲劑所有食品動物19性激素類：甲基睪丸酮、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍、苯甲酸雌二醇及其鹽、酯及制劑促生長所有食品動物20催眠、鎮(zhèn)靜類：氯丙嗪、地西泮、及其鹽、酯及制劑促生長所有食品動物21硝基咪唑類：甲硝唑、地美硝唑及其鹽、酯及制劑促生長所有食品動物當前第26頁\共有100頁\編于星期四\20點

已發(fā)布獸藥殘留檢測方法標準超過1000個，從2001年開始實施獸藥殘留監(jiān)控計劃，各?。ㄊ校┮蚕鄳?yīng)制定并實施地方殘留監(jiān)控計劃。以2009年度農(nóng)業(yè)部動物性產(chǎn)品中獸藥殘留監(jiān)控計劃為例，抽檢動物包括牛、豬、羊、雞、水產(chǎn)和蜂，抽檢產(chǎn)品有牛奶、肉、肝、蜂蜜等，其他還有尿樣。當前第27頁\共有100頁\編于星期四\20點

已發(fā)布獸藥殘留檢測方法標準超過1000個，從2001年開始實施獸藥殘留監(jiān)控計劃，各省（市）也相應(yīng)制定并實施地方殘留監(jiān)控計劃。以2009年度農(nóng)業(yè)部動物性產(chǎn)品中獸藥殘留監(jiān)控計劃為例，抽檢動物包括牛、豬、羊、雞、水產(chǎn)和蜂，抽檢產(chǎn)品有牛奶、肉、肝、蜂蜜等，其他還有尿樣。當前第28頁\共有100頁\編于星期四\20點1、雞組織中獸藥殘留監(jiān)控計劃化合物動物/組織樣品來源檢樣數(shù)氟喹諾酮類雞/蛋遼寧等8個省250雞/肝225磺胺類雞/肝廣西等10個省355雞/肉387四環(huán)素類雞/肉安徽等5個省350泰樂菌素雞/肉河北等3個省200氯羥吡啶雞/肉江蘇等2個省200氯霉素雞/肝北京等10個省750雞/肉山東等7個省500地美硝唑/甲硝唑雞/肝遼寧等6個省430硝基呋喃類代謝物雞/肉上海等9個省550小計4197當前第29頁\共有100頁\編于星期四\20點2、牛奶中獸藥殘留監(jiān)控計劃化合物動物/組織樣品來源檢樣數(shù)氨基糖苷類牛/牛奶上海等5個省250青霉素類牛/牛奶內(nèi)蒙古等9個省500磺胺類牛/牛奶北京等5個省280四環(huán)素類牛/牛奶北京50鏈霉素牛/牛奶河北等5個省300氯霉素牛/牛奶黑龍江等3個省155小計1535當前第30頁\共有100頁\編于星期四\20點3、羊組織中獸藥殘留監(jiān)控計劃化合物動物/組織樣品來源檢樣數(shù)磺胺類羊/肉新疆200氯霉素羊/肉內(nèi)蒙古50小計250當前第31頁\共有100頁\編于星期四\20點4、豬組織中獸藥殘留監(jiān)控計劃化合物動物/組織樣品來源檢樣數(shù)磺胺類豬/肉四川等13個省1062四環(huán)素類豬/肉甘肅等4個省200氟喹諾酮類豬/肉廣東等6個省350喹乙醇殘留標示物豬/肉吉林等5個省350克倫特羅豬/肝北京等6個省350豬/尿湖南等7個省550卡巴氧殘留標示物豬/肝黑龍江等5個省500硝基呋喃類代謝物豬/肉浙江等5個省240地美硝唑/甲硝唑豬/肉重慶等6個省500小計4102當前第32頁\共有100頁\編于星期四\20點5、蜂蜜中獸藥殘留監(jiān)控計劃化合物動物/組織樣品來源檢樣數(shù)四環(huán)素類蜂/蜂蜜浙江等55氟喹諾酮類蜂/蜂蜜北京等35磺胺類蜂/蜂蜜四川等40氯霉素蜂/蜂蜜遼寧等80硝基咪唑類蜂/蜂蜜湖北等40小計250當前第33頁\共有100頁\編于星期四\20點6、水產(chǎn)品中獸藥殘留監(jiān)控計劃化合物動物/組織樣品來源檢樣數(shù)氯霉素斑點叉尾蛔/肉江西等129草魚/肉416大黃魚/肉42淡水小龍蝦/肉88對蝦/肉268鯽魚/肉304鯉魚/肉360其他322小計1929當前第34頁\共有100頁\編于星期四\20點化合物動物/組織樣品來源檢樣數(shù)孔雀石綠斑點叉尾蛔/肉江蘇等179草魚/肉416鯽魚/肉264鯉魚/肉400甲魚/肉96羅非魚/肉175鰻鱺/肉114其他510小計2154當前第35頁\共有100頁\編于星期四\20點化合物動物/組織樣品來源檢樣數(shù)己烯雌酚對蝦/肉江蘇等422淡水小龍蝦/肉44硝基呋喃代謝物斑點叉尾蛔/肉湖北等71草魚/肉133對蝦/肉86河蟹/肉51鯽魚/肉85甲魚/肉31鯉魚/肉103羅非魚/肉66其他178當前第36頁\共有100頁\編于星期四\20點化合物動物/組織樣品來源檢樣數(shù)喹乙醇草魚/肉北京等416五氯酚納河蟹/肉遼寧等240甲基睪酮羅非魚/肉河北等175鰻鱺/肉114當前第37頁\共有100頁\編于星期四\20點化學物及代謝物分離純化監(jiān)控獸藥等化學物樣品檢測方法快速檢測方法儀器確證方法固相萃取技術(shù)基質(zhì)固相分散技術(shù)免疫親和色譜技術(shù)分子印跡技術(shù)超臨界萃取技術(shù)四、有害化合物殘留檢測技術(shù)當前第38頁\共有100頁\編于星期四\20點微生物抑制測定法酶聯(lián)免疫吸附測定法量子點標記熒光檢測法熒光偏振免疫檢測法化學發(fā)光免疫檢測法放射免疫測定法金標試紙條生物傳感器生物芯片1、快速檢測方法當前第39頁\共有100頁\編于星期四\20點熒光偏振免疫分析技術(shù)熒光偏振免疫分析（Fluorescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA）是競爭性的均相免疫分析方法，就是檢測熒光標記抗原（tracer）在結(jié)合特異性的抗體前后，熒光偏振值（FP）值的變化，不需要分離結(jié)合的和未結(jié)合的抗體，經(jīng)過幾分鐘甚至是幾秒鐘的溫育便可直接測量，很快得到被測藥物的濃度，實驗的時間僅僅決定于加樣的時間當前第40頁\共有100頁\編于星期四\20點FPIA

是競爭性的均相免疫分析抗原濃度低

FP值高AgAgAgAbAbAgAgAgAbAbAgAgPAgFAgFAgFAgF抗原濃度高

FP值小AgAbAbAgAbAgFAgFAbAgFAgFP當前第41頁\共有100頁\編于星期四\20點熒光素與磺胺二甲基嘧啶偶聯(lián)SM2-FITCTLC分離純化當前第42頁\共有100頁\編于星期四\20點FFFFFYYYYYYYFFYFYFFY測定熒光偏振值當前第43頁\共有100頁\編于星期四\20點

藥物最低檢測限ng/mL半數(shù)抑制量ng/mL回收率（%）磺胺二甲基嘧啶116雞肉：78-89磺胺氯吡嗪0.2529牛奶：60-120磺胺甲氧吡嗪0.711.5牛奶：68-145馬杜霉素2160雞肉：92-132雞脂肪：92-121雞蛋：125-82鹽霉素0.0833.2-喹諾酮類（12種）0.1-110-20牛奶：70-110幾種獸藥檢測分析結(jié)果當前第44頁\共有100頁\編于星期四\20點FluorescencePolarizationImmunoassayforSalinomycinBasedonMonoclonalAntibody，ScienceChina:Chemistry，2010，53，553-555Determinationofveterinarydrugmaduramicininfoodbyfluorescencepolarizationimmunoassay,InternationalJournalofFoodScienceandTechnology.2008，43,114-122.Simultaneousdeterminationofsulphamerazine,sulphamethazineandsulphadiazineinhoneyandchickenmusclebyfluorescencepolarisationimmunoassaybasedonmonoclonalantibody.2008,

FoodAdditivesandContaminants,25(5):574-582.

MonoclonalAntibody-BasedFluorescencePolarizationimmunoassayfortheveterinarydrugSulfamethoxypyridazineandSulfachloropyridazineinMilk,JournalofAgricultureandFoodChemistry,2007，55(17):6871-6878.Fluorescencepolarisationimmunoassaybasedonamonoclonalantibodyforthedetectionofsulfamethazineinchickenmuscle,InternationalJournalofFoodScienceandTechnology，2007，42,36-44熒光偏振免疫分析檢測磺胺二甲基嘧啶殘留研究,分析化學.2007，35(6):819–824發(fā)表文章當前第45頁\共有100頁\編于星期四\20點時間分辯免疫分析技術(shù)

時間分辨熒光免疫分析（TrFIA）是利用鑭系絡(luò)合物作為標記物的免疫分析技術(shù)，其絡(luò)合物具有熒光壽命長、激發(fā)光譜帶較寬、發(fā)射光譜帶甚窄和Stokes位移大等特點，可以消除背景熒光的干擾，有效提高檢測方法的靈敏度當前第46頁\共有100頁\編于星期四\20點雙抗夾心TR-FIA反應(yīng)原理示意圖氯霉素萊克多巴胺當前第47頁\共有100頁\編于星期四\20點發(fā)表文章Amonoclonalantibody-basedtime-resolvedfluoroimmunoassayforchloramphenicolinshrimpandchickenmuscle,AnalyticaChimicaActa,2006,

575(2):262-6Time-resolvedFluoroimmunoassayforRactopamineinSwineTissue，JournalofAgricultureFoodandChemistry.2007,387,1561-1564當前第48頁\共有100頁\編于星期四\20點化學發(fā)光免疫分析技術(shù)

化學發(fā)光免疫分析（CLIA），一般分為兩種模式。第一種是以發(fā)光劑作為酶免疫測定的底物，通過發(fā)光反應(yīng)增強測定的敏感性；第二種是以發(fā)光劑作為抗體或抗原的標記物，直接通過發(fā)光反應(yīng)檢測標本中抗原或抗體的含量當前第49頁\共有100頁\編于星期四\20點Cl-ELISA與傳統(tǒng)ELISA靈敏度比較Cl-ELISAELISADevelopmentofaChemiluminescentELISAforDeterminingChloramphenicolinChickenMuscle，JournalofAgricultureFoodandChemistry,2006,54(16),5718–5722化學發(fā)光免疫檢測氯霉素當前第50頁\共有100頁\編于星期四\20點

量子點標記免疫分析技術(shù)

量子點(quantumdots，QDs)又稱半導(dǎo)體納米微晶體，是一種由II-VI族或Ⅲ-V族元素組成的，直徑約為1-100nm，能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米顆粒，量子點表面結(jié)構(gòu)經(jīng)過修飾，借助于其外端的羧基，能與生物分子的氨基相結(jié)合，如抗體等偶聯(lián)當前第51頁\共有100頁\編于星期四\20點發(fā)表文章1.Simultaneousdetectionofmultiplechemicalresiduesinmilkusingbroad-specificityantibodiesinahybridimmunosorbentassay，Biosens.Bioelectron，2010，

aheadofprint2.Characterizationandapplicationofquantumdotnanocrystalmonoclonalantibodyconjugatesforthedeterminationofsulfamethazineinmilkbyfluoroimmunoassay.2007.AnalBioanalChem.389,2243-2250.3.Theapplicationofquantumdotantibodyconjugatesfordetectionofsulfamethaz-ineresidueinchickenmuscletissue.2006.JAgrFoodChem.54(17),6139-6142.4.量子點的應(yīng)用---種新型的熒光定量檢測技術(shù).中國獸醫(yī)雜志,2007,43(6):69~70.當前第52頁\共有100頁\編于星期四\20點2、儀器分析方法氣相色譜法（GC）高效液相色譜法（HPLC）原子熒光法(AF)原子吸收法(AA)氣譜-質(zhì)譜法（GC-MS）氣譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）液譜-質(zhì)譜法（LC-MS）液譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）當前第53頁\共有100頁\編于星期四\20點1pg/g1ng/g1g/g1mg/g紫外/可見分光光度法放射免疫測定法/酶免疫測定法色質(zhì)聯(lián)用分析放射受體分析氣相色譜(ECD/NPD)氣相色譜(FID)高效液相色譜(FLD/UVD)極譜法熒光分光光度法微生物測定法比色法各種測定方法的靈敏度范圍當前第54頁\共有100頁\編于星期四\20點有害化合物殘留檢測：先用快速檢測產(chǎn)品進行篩查，可疑陽性樣品再用儀器分析方法尤其是色質(zhì)聯(lián)用檢測方法加以確證。美國、歐盟、日本等均采用此策略，抽檢數(shù)量超過總樣品數(shù)的10%！當前第55頁\共有100頁\編于星期四\20點1、快速檢測產(chǎn)品種類試劑盒試紙條生物傳感器免疫芯片快速檢測儀檢測箱目前主要的快速檢測產(chǎn)品包括:五、快速檢測產(chǎn)品研制當前第56頁\共有100頁\編于星期四\20點2、小分子抗體制備技術(shù)目前抗體種類主要是多抗和單抗替代抗體：基因重組抗體、納米抗體、核酸適配體、抗轉(zhuǎn)運蛋白、受體、分子印跡聚合物等均有相關(guān)研究核酸適配體抗轉(zhuǎn)運蛋白當前第57頁\共有100頁\編于星期四\20點當前第58頁\共有100頁\編于星期四\20點

獸藥分子量大都小于1000，藥物本身沒有免疫原性，必須經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造后與大分子載體蛋白結(jié)合才能產(chǎn)生有效抗體半抗原當前第59頁\共有100頁\編于星期四\20點信息含量豐富的半抗原合理設(shè)計小分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化計算化學性質(zhì)參數(shù)（物化、電量、空間等信息）最佳半抗原免疫動物抗體合適抗原表位間隔臂最佳半抗原統(tǒng)計分析當前第60頁\共有100頁\編于星期四\20點應(yīng)用量子力學AM1，得到了磺胺類和玉米赤霉醇類藥物的物化、電性、疏水性等性質(zhì)，從分子水平比較各藥物與半抗原的異同（化學學報，2008，66，2613-2619）。為半抗原合理設(shè)計提供了方法指導(dǎo)SM2化學結(jié)構(gòu)SM2最低能量構(gòu)象SM2最高占據(jù)軌道（HOMO）和最低未占據(jù)軌道（LUMO）當前第61頁\共有100頁\編于星期四\20點玉米赤霉醇類藥物的三維構(gòu)象和電荷分布當前第62頁\共有100頁\編于星期四\20點Table2.Physicalandchemicalindexesofα-zearalanolandanalogsHaptensVSRLogPPμHMWD18-14D18-16α-zearalanol937.37601.8590.381.1634.312.949952.51322.4011.189.37β-zearalanol925.51597.5790.381.1634.310.992254.12322.409.567.99α-zearalenol903.64583.5491.500.9034.123.203352.68320.397.996.47β-zearalenol916.33644.5591.500.9034.124.20850.39320.399.357.21zearalanone909.49593.3189.351.3733.763.4748113.07320.3910.059.33zearalenone905.71603.7490.471.1033.575.6308111.13318.378.106.44Table3.Quantumchemicalindexesofα-zearalanolandanalogsHaptensQO1QO3QO14QO16QO18QC11QC12QC17EHOMOELUMO△Eα-zearalanol-0.4326-0.4929-0.6257-0.6153-0.6187-0.2388-0.3347-0.4067-12.297-1.70610.591β-zearalanol-0.4346-0.4910-0.6262-0.6155-0.6129-0.2374-0.3352-0.4071-11.988-0.88711.101α-zearalenol-0.4753-0.4830-0.6256-0.6132-0.6588-0.0885-0.1590-0.3931-12.252-2.3889.864β-zearalenol-0.4275-0.4938-0.6267-0.6147-0.6223-0.0709-0.1646-0.4037-12.190-2.14810.042zearalanone-0.4088-0.5095-0.6254-0.6117-0.4218-0.2544-0.3338-0.4040-11.722-1.8089.914zearalenone-0.4201-0.5000-0.6295-0.6155-0.4277-0.0919-0.1465-0.4120-11.882-2.5399.343玉米赤霉醇類藥物的結(jié)構(gòu)信息Table4.PearsonCorrelationanalysisformoleculardescriptorsandantibodyrecognitionabilityVHLogPRMWSμ△EQO1QO3QO14QO16QO18QC11QC12QC17D18-14D18-16PersonCorrelation-0.002-0.35-0.540.54-0.100.880.25-0.070.120.07-0.06-0.12-0.280.510.400.05-.001-0.22Sig.(2-tailed)0.9970.490.260.260.840.010.630.880.820.890.900.810.580.290.420.910.980.67ZHWang，JZShen.2009.JournalofMolecularRecognition,submitted.疏水性體積偶極距分子距離電量相關(guān)系數(shù)獲得的分子結(jié)構(gòu)信息，已用于半抗原的合理設(shè)計當前第63頁\共有100頁\編于星期四\20點單克隆抗體制備過程當前第64頁\共有100頁\編于星期四\20點脾細胞雜交瘤細胞基因重組抗體制備當前第65頁\共有100頁\編于星期四\20點噬菌體展示抗體庫淘選策略scFv當前第66頁\共有100頁\編于星期四\20點雙特異性單鏈抗體制備策略ScFv1LinkerScFv2BispesificscFvBroad-specificityantibodypCANTAB5E-bispesificscFv磺胺類喹諾酮類識別磺胺類和喹諾酮類當前第67頁\共有100頁\編于星期四\20點抗體評價及指導(dǎo)抗體定向改造CoMFA初步測定抗體特性3D-QSAR重組抗體Docking獲取獸藥-抗體互作主要力場預(yù)測抗體三維結(jié)構(gòu)互作模型重組抗體定向改造同源模擬獲取獸藥-抗體互作結(jié)構(gòu)信息推測獸藥-抗體間發(fā)生作用的氨基酸性質(zhì)推測獸藥-抗體間發(fā)生作用的氨基酸位點ELISA當前第68頁\共有100頁\編于星期四\20點受體抗體（Acceptor）UniSenesor公司研發(fā)了基于受體的可同時檢測13種青霉素和四環(huán)素兩類藥物的試紙條產(chǎn)品中國農(nóng)大和北京維德維康公司合作研發(fā)可同時檢測15種青霉素和頭孢類藥物的試紙條產(chǎn)品受體作為特異性識別的生物大分子，因其分離純化及體外構(gòu)建均較復(fù)雜，應(yīng)用于免疫分析的報道很少TwinSensorBT當前第69頁\共有100頁\編于星期四\20點放射性受體分析法1978年美國波士頓大學教授Charm發(fā)明受體分析法 CHARMI是專用于牛奶中β一內(nèi)酰胺抗生素殘留檢測方法，也是美國AOAC承認的第一個快速測定法，這個方法非?？焖俸挽`敏，一個奶牛樣品分析只需15分鐘時間目前，CHARM被多國政府的農(nóng)業(yè)部和衛(wèi)生部采用作為的標準方法如我國:四環(huán)素類（SN/T2309-2009），β-內(nèi)酰胺類(GB/T21174-2007)，磺胺類(GB/T21173-2007)

細胞膜上或細胞內(nèi)能特異識別生物活性分子并與之結(jié)合，進而引起生物學效應(yīng)的特殊蛋白質(zhì)當前第70頁\共有100頁\編于星期四\20點微孔板檢測系統(tǒng)基于膜的檢測系統(tǒng)表面等離子共振傳感器側(cè)流層析技術(shù)免疫滲濾技術(shù)熒光分析系統(tǒng)CHARM原理當前第71頁\共有100頁\編于星期四\20點受體分析法的優(yōu)勢：可以檢測同一類抗生素難點：受體的制備檢測方法的應(yīng)用目的基因的調(diào)取目的蛋白活性鑒定目的蛋白的表達及純化表達載體的構(gòu)建基于受體的快速檢測方法建立檢測方法的優(yōu)化

青霉素等β-內(nèi)酰胺類抗生素通過與細菌膜蛋白結(jié)合，抑制細菌細胞壁的生物合成，引起細菌細胞死亡從而發(fā)揮殺菌作用的。這種細菌蛋白被命名為青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin-BindingProtein，PBP)2001年發(fā)現(xiàn)了肺炎鏈球菌野生R6株5個編碼明確的青霉素結(jié)合蛋白的基因，其中PBP2x對青霉素類和頭孢類抗生素都具有很高的敏感性當前第72頁\共有100頁\編于星期四\20點青霉素結(jié)合蛋白識別β-內(nèi)酰胺藥物列表當前第73頁\共有100頁\編于星期四\20點當前第74頁\共有100頁\編于星期四\20點基本原理目前常用的主要為ELISA試劑盒。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量有一定的比例，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。

（1）試劑盒3、試劑盒、試紙條研制當前第75頁\共有100頁\編于星期四\20點1、加入待測物；2、加入抗體；3、加入酶標二體；4、加入底物；5、加入終止液目前試劑盒最常用方法為間接競爭ELISA法，其他還用直接法、夾心法等。當前第76頁\共有100頁\編于星期四\20點優(yōu)點

靈敏度高，特異性強，可進行定性和定量測定檢測方便、快捷，一般1-2個小時就能出結(jié)果對操作者和實驗室條件要求不高可以用于大量樣本的快速篩選當前第77頁\共有100頁\編于星期四\20點試劑盒組成

96孔酶標版樣品稀釋液標準溶液底物溶液終止液酶標二抗工作液濃縮洗滌液抗體工作液當前第78頁\共有100頁\編于星期四\20點試劑盒檢測需要的儀器恒溫搖床離心機恒溫培養(yǎng)箱渦動儀酶標分析儀移液槍當前第79頁\共有100頁\編于星期四\20點試劑盒檢測所需試劑主要用于復(fù)雜樣品（如肌肉、肝臟等）的前處理。大多為常規(guī)有機或無機溶劑，1、甲醇2、乙腈3、乙酸乙酯4、磷酸鹽緩沖溶液5、……當前第80頁\共有100頁\編于星期四\20點YP1YP2YP3YP4YP5YP6YP7YP8YP1YP2YP3YP4YP5YP6YP7YP8YP9YP10YP11YP12YP13YP14YP15YP16YP9YP10YP11YP12YP13YP14YP15YP16YP17YP18YP19YP20YP21YP22YP23YP24YP17YP18YP19YP20YP21YP22YP23YP24YP25YP26YP27YP28YP29YP30YP31YP32YP25YP26YP27YP28YP29YP30YP31YP32YP33YP34YP35YP36YP37YP38YP39YP40YP33YP34YP35YP36YP37YP38YP39YP40BZ1BZ2BZ3BZ4BZ5BZ6陽性陰性BZ1BZ2BZ3BZ4BZ5BZ6陽性陰性ABCDEFGH123456789101112由低到高的標準溶液，用于繪制標準曲線陽性添加樣品孔陰性添加樣品孔實測樣品區(qū)，最多可檢測40個樣品酶標板實際檢測布局當前第81頁\共有100頁\編于星期四\20點試劑盒一般操作步驟1、向酶標板微孔中加入標準品溶液或樣本溶液，再加入一抗，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中孵育；2、倒出孔中液體，加入濃縮洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作，用吸水紙拍干；3、加入酶標二抗，37℃恒溫箱中孵育；4、倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟；5、加入底物顯色液A液，底物顯色液B液，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15min；6、加入終止液，輕輕振蕩混勻；7、用酶標儀，測定每孔吸光度值。當前第82頁\共有100頁\編于星期四\20點結(jié)果判定標準曲線法：所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值（%）＝B/B0×100%B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0—0μg/L標準溶液的平均吸光度值當前第83頁\共有100頁\編于星期四\20點以檢測標準濃度(μg/L)的自然對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。相對應(yīng)每一個樣品的濃度(μg/kg)可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。0102030405060708090100103090270810待測物濃度（ppb）吸光度（%）1當前第84頁\共有100頁\編于星期四\20點試紙條結(jié)構(gòu)基本原理

采用競爭法，樣品滴入后，在層析作用下經(jīng)膠體金標記抗體的結(jié)