分子發(fā)光分析法演示文稿

分子發(fā)光分析法演示文稿當前第1頁\共有63頁\編于星期四\20點分子發(fā)光分析法當前第2頁\共有63頁\編于星期四\20點物質分子吸收了一定能量后,其電子由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài),當激發(fā)態(tài)分子以輻射形式將其能量釋放返回基態(tài)時,便產生分子發(fā)光。根據(jù)這種現(xiàn)象建立的分析方法稱為發(fā)光分析法。當前第3頁\共有63頁\編于星期四\20點根據(jù)分子受激時所吸收能源及輻射光的機理不同分為以下幾類：

光致發(fā)光：以光源來激發(fā)而發(fā)光電致發(fā)光：以電能來激發(fā)而發(fā)光生物發(fā)光：以生物體釋放的能量激發(fā)而發(fā)光化學發(fā)光：以化學反應能激發(fā)而發(fā)光當前第4頁\共有63頁\編于星期四\20點分子熒光和磷光分析化學發(fā)光當前第5頁\共有63頁\編于星期四\20點一、基本原理1、熒光和磷光的產生室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動能層。處于基態(tài)的分子吸收能量后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變?yōu)榛鶓B(tài)。若返回到基態(tài)時伴隨著光子的輻射，這種現(xiàn)象成為“發(fā)光”。由于吸收光能而導致的發(fā)光稱為光致發(fā)光。當前第6頁\共有63頁\編于星期四\20點處于基態(tài)的分子吸收能量后發(fā)生躍遷：當前第7頁\共有63頁\編于星期四\20點激發(fā)態(tài)分子的去活化過程

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷（發(fā)光）和無輻射躍遷等方式失去能量，稱為去活化過程。去活化非輻射躍遷化學反應發(fā)射光子振動馳豫內轉換系間跨越外轉換熄滅或猝滅熒光磷光激發(fā)光去除后，磷光不會立即消失激發(fā)光去除后，熒光立即消失當前第8頁\共有63頁\編于星期四\20點熒光和磷光體系能級圖當前第9頁\共有63頁\編于星期四\20點2、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜:固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關系曲線（圖中曲線I）激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀極為相似，經(jīng)校正后二者完全相同！發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關系曲線(圖中曲線II或III)。當前第10頁\共有63頁\編于星期四\20點當前第11頁\共有63頁\編于星期四\20點激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的關系A.Stokes位移B.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關C.鏡像規(guī)則當前第12頁\共有63頁\編于星期四\20點A.基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似。激發(fā)：基態(tài)→第一激發(fā)態(tài)各振動能級，振動能級越高，能級差越大，波長就越短。

發(fā)射熒光：從第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級→基態(tài)的各振動能級，基態(tài)的振動能級越高，其能量差越小，波長就越長。

吸收光譜中能級越高波長越短，發(fā)射光譜中能級越高，波長越長?；殓R像當前第13頁\共有63頁\編于星期四\20點4043211023當前第14頁\共有63頁\編于星期四\20點B.基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

當前第15頁\共有63頁\編于星期四\20點當前第16頁\共有63頁\編于星期四\20點3、熒光與分子結構的關系（內因）分子熒光產生的必備條件:分子必須具備與所照射的輻射頻率相適應的結構吸收激發(fā)光的分子必須具有一定的熒光量子產率當前第17頁\共有63頁\編于星期四\20點影響因素：熒光產生過程中，輻射和無輻射過程；與每一過程的速率常數(shù)有關；Kf分子結構決定（內因）；主要取決于化學結構和化學環(huán)境和結構共同決定。當前第18頁\共有63頁\編于星期四\20點熒光與分子結構的關系（外因）（1）躍遷類型：具有電子躍遷類型的結構當前第19頁\共有63頁\編于星期四\20點（2）、共軛效應具有共軛體系的芳環(huán)或雜環(huán)化合物，電子共軛程度越大，越易產生熒光;環(huán)越多，共軛程度越大，產生熒光波長越長（紅移），發(fā)射的熒光強度越強（3）、剛性平面結構—較穩(wěn)定的平面結構當前第20頁\共有63頁\編于星期四\20點當前第21頁\共有63頁\編于星期四\20點（4）取代基效應1）給電子取代劑加強熒光—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN產生p→π共軛相對熒光強度1018202020λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚2）吸電子取代基減弱熒光、加強磷光當前第22頁\共有63頁\編于星期四\20點芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強，磷光增強，熒光減弱。其熒光強度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光相應增強，這種效應為重原子效應。其原因是重原子的電子自旋和軌道運動間的相互作用變大，原子核附近產生磁場，使單重態(tài)向多重態(tài)系間跨越的幾率增加。當前第23頁\共有63頁\編于星期四\20點當前第24頁\共有63頁\編于星期四\20點當前第25頁\共有63頁\編于星期四\20點(2)影響熒光強度的因素溶劑的影響（增大溶劑的極性熒光增強）溫度的影響酸度的影響（芳香族化合物的官能團，金屬與有機試劑螯合）內濾光和自吸收現(xiàn)象散射光的影響當前第26頁\共有63頁\編于星期四\20點(3)溶液熒光的猝滅

熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子的相互作用引起熒光強度降低或熒光強度不與濃度成線性關系的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。能引起熒光猝滅的物質叫熒光熄滅劑碰撞猝滅M+hv→M*,M*+Q→

M+熱靜態(tài)猝滅M+Q→

MQ非熒光物質轉入三重態(tài)的猝滅引入碘、溴后，易發(fā)生體系間跨越熒光物質的自猝滅熒光物質濃度較高發(fā)生電荷轉移反應的猝滅當前第27頁\共有63頁\編于星期四\20點二、熒光（磷光）光譜儀熒光分光光度計的主要部件：光源、激發(fā)單色器、發(fā)射單色器、樣品池、檢測系統(tǒng)、顯示系統(tǒng)。光源激發(fā)單色器樣品池發(fā)射單色器檢測器放大器指示器·記錄器與分光光度計有兩點不同：①兩個單色器②檢測器與激發(fā)光成直角當前第28頁\共有63頁\編于星期四\20點1.光源激發(fā)光源一般要求比吸收測量中的光源有更大的發(fā)射強度；適用波長范圍寬熒光光度計中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強應用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強的連續(xù)光源當前第29頁\共有63頁\編于星期四\20點2、單色器第一單色器作用：激發(fā)單色器，分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長ex。第二單色器作用：發(fā)射單色器，濾掉一些雜散光和雜質所發(fā)射的干擾光，用來選擇測定用的熒光波長em。當前第30頁\共有63頁\編于星期四\20點3、樣品池通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊。4、檢測器熒光的強度一般較弱，要求檢測器有較高的靈敏度，熒光光度計采用光電倍增管當前第31頁\共有63頁\編于星期四\20點SK-2003A型熒光光譜儀(國內首創(chuàng)）當前第32頁\共有63頁\編于星期四\20點磷光分析法與熒光相比，磷光的特點：1、磷光壽命比熒光長2、磷光輻射的波長比熒光長（一）磷光強度：Ip＝KC（二）溫度對磷光強度的影響試樣需在液氮溫度（77K）或液氦（4K）下測定當前第33頁\共有63頁\編于星期四\20點磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，主要差異如下：1.試樣室試樣需在液氮溫度（77K）或液氦（4K）下測定－低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶內）

固體表面室溫磷光分析需特制試樣室2.磷光鏡有些物質既可產生熒光，又能產生磷光。用機械切光裝置——磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長消除熒光干擾。當前第34頁\共有63頁\編于星期四\20點磷光儀器在熒光儀樣品池上增加磷光配件：低溫杜瓦瓶和斬光片。如右圖所示。斬光片的作用是利用其分子受激所產生的熒光與磷光的壽命不同獲取磷光輻射（書中96頁）當前第35頁\共有63頁\編于星期四\20點室溫磷光低溫熒光需低溫實驗裝置且受到溶劑選擇的限制，1974年后發(fā)展了室溫磷光（RTP）。1）固體基質室溫磷光在室溫下以固體基質（如纖維素等）吸附磷光體，增加分子剛性、減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率。2）膠束增穩(wěn)室溫磷光利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變磷光體的微環(huán)境、增加定向約束力，從而減小內轉換和碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性。3）敏化溶液室溫磷光當前第36頁\共有63頁\編于星期四\20點三、熒光分析方法和應用1、熒光分析法分類一、直接熒光法：芳香族有機化合物分析二、間接熒光法（衍生化法和熒光探針法）2、熒光分析法的特點：（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2~4個數(shù)量級，檢測下限在0.1~0.001μg/mL（2）選擇性好熒光法既能依據(jù)特定發(fā)射，又能依據(jù)特定吸收來鑒定物質（3）試樣量少和方法簡單（4）提供比較多的物理參數(shù)當前第37頁\共有63頁\編于星期四\20點3、應用一、定性分析熒光物質的特征光譜有激發(fā)光譜和熒光光譜兩種，可以將熒光物質的特征光譜與標準物質的光譜比較，以確定是否為同一物質。二、定量分析定量分析依據(jù)F=KC當前第38頁\共有63頁\編于星期四\20點三、無機化合物的分析無機化合物中，能直接產生熒光并應用于測定的為數(shù)不多，但與有機化合物生成發(fā)熒光的有機配合物后，進行熒光分析的元素達幾十種，其中較常采用熒光法測定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素熒光猝滅法也是熒光分析中經(jīng)常采用的方法。可采用熒光猝滅法間接測定的離子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等當前第39頁\共有63頁\編于星期四\20點2.有機化合物的分析脂肪族有機化合物的分子結構較為簡單，本身能發(fā)熒光的很少，芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)熒光；可直接用熒光法測定。但是為提高熒光分析的靈敏度和選擇性，大多數(shù)采用熒光衍生化法。3.熒光檢測與色譜分離聯(lián)用4.熒光免疫分析當前第40頁\共有63頁\編于星期四\20點化學發(fā)光分析一、概述化學發(fā)光是吸收化學反應所釋放化學能而使分子發(fā)光所建立的分析方法化學發(fā)光與熒光的主要區(qū)別：受激發(fā)時所需的能量來源不同，需要化學反應過程中所提供的化學能當前第41頁\共有63頁\編于星期四\20點化學發(fā)光分析具有以下特點靈敏度高——例：用熒光素酶和三磷酸腺苷ATP的化學發(fā)光反應，可測定低至2×10-17mol·L-1的ATP線性范圍寬——一般有5~6個數(shù)量級儀器設備簡單，成本低廉分析速度快，易實現(xiàn)自動化局限性：可供發(fā)光用的試劑有限發(fā)光機理有待進一步研究當前第42頁\共有63頁\編于星期四\20點二、化學發(fā)光分析的基本原理（一）化學發(fā)光反應的基本條件發(fā)光反應必須滿足以下條件

1.化學反應必須產生足夠的化學能化學發(fā)光基于化學反應提供足夠的能量A+B→C*+D產物接受反應能被激發(fā)C*→C+h在可見光區(qū)觀察化學發(fā)光，需170~300kJ·mol-1激發(fā)能。具有過氧化物中間產物的氧化還原反應可滿足要求?；瘜W反應多是在有O3、H2O2等參加的氧化還原反應中

2.要有有利的化學反應歷程。3.處于激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)當前第43頁\共有63頁\編于星期四\20點（二）化學發(fā)光效率和發(fā)光強度1、化學發(fā)光效率CL激發(fā)態(tài)分子的化學效率發(fā)光效率當前第44頁\共有63頁\編于星期四\20點三、化學發(fā)光反應類型1、直接化學發(fā)光和間接化學發(fā)光（1）直接化學發(fā)光A+B→C*+DC*→C+h產物接受反應能被激發(fā)當前第45頁\共有63頁\編于星期四\20點（2）間接化學發(fā)光A+B→C*+DC*+F→F*+EF*→F+h

C*:能量給予體F:能量接收體例：羅丹明B-沒食子酸的乙醇溶液測定大氣中的O3沒食子酸+O3→A*+O2A*+羅丹明B→羅丹明B*+B羅丹明B*→羅丹明B+hmax＝584nm當前第46頁\共有63頁\編于星期四\20點2.氣相化學發(fā)光——廣泛應用于大氣污染監(jiān)測、可監(jiān)測空氣中的O3；NO、NO2；SO2；H2S；CO；乙烯等。在氣相中O3能氧化NO、乙烯等產生化學發(fā)光，原子氧也能氧化NO、SO2、CO等產生化學發(fā)光。例1：NO+O3→NO2*+O2NO2*→NO2+h（≥600nm）常溫下產生化學發(fā)光，靈敏度可達1ng·mL-1測定范圍0.01~10000g·mL-1

例1：CO+O（原子氧）→CO2*CO2*→CO2+h（=300~500nm）靈敏度為1ng·mL-1當前第47頁\共有63頁\編于星期四\20點3.液相化學發(fā)光研究和應用的比較廣泛的有：魯米諾、光澤精、沒食子酸、洛粉堿、過氧草酸鹽等。魯米諾是最常用的發(fā)光試劑，它可以測定Cl2、HClO、ClO-、H2O2、O2和NO2，產生化學發(fā)光反應時量子效率為0.01~0.05魯米諾（3–氨基苯二甲酰環(huán)肼）在堿性溶液中和H2O2等氧化劑反應生成最大波長為425nm的光輻射當前第48頁\共有63頁\編于星期四\20點425nm反應產生的化學能被產物氨基鄰苯二甲酸根吸收，處于激發(fā)狀態(tài)，返回基態(tài)時發(fā)射熒光可檢測低至10-9mol·L-1的H2O2當前第49頁\共有63頁\編于星期四\20點四、生物發(fā)光體系生物發(fā)光是化學發(fā)光的一種特殊體系，如水母、細菌、真菌、蠕蟲還有螢火蟲等。蟲熒光素+ATP+O2在蟲熒光素酶的催化下產生氧蟲熒光素+ADP+發(fā)光五、電化學發(fā)光電解質溶液電解反應所產生的光發(fā)射稱為電化學發(fā)光。當前第50頁\共有63頁\編于星期四\20點當前第51頁\共有63頁\編于星期四\20點還原型谷胱甘肽(GSH)是一種具有重要生理功能的活性三肽，它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成，廣泛存在于自然界的生物體內，具有保護血管、抗HlV、保護神經(jīng)、抗驚厥及鎮(zhèn)痛等作用。敏度的檢測方法的研究仍具有實際意義。本工作利用1，8一蒽二磺酰胺對Hg2+離子的高效選擇性，通過加入GSH與Hg2+絡合從而使1，8一蒽二磺酰胺熒光增強，據(jù)此測定GSH。當前第52頁\共有63頁\編于星期四\20點1、實驗部分1．1儀器熒光分光光度計，HitachiF一4500型，日本日立公司；自動雙重純水蒸餾器，SZ-93型，上海亞榮生化儀器廠；酸度計，pH孓25型，上海雷磁儀器廠。1．2實驗原理1，8一蒽二磺酰胺(以下簡稱磺酰胺，簡寫ASA)具有較強的熒光，加入Hg2+離子后，Hg2十與磺酰胺絡合使其熒光猝滅。當向Hg2+一ASA體系中加入谷胱甘肽(GSH)時，GSH中的巰基(一SH)與Hg2+絡合，釋放出與H礦+結合的磺酰胺而使體系的熒光增強，據(jù)此達到測定GSH含量的目的，原理見圖1。當前第53頁\共有63頁\編于星期四\20點當前第54頁\共有63頁\編于星期四\20點1．3實驗方法1．3．1發(fā)射光譜的掃描分別向三支EP管中加入1．58×10-5mol/L磺酰胺溶液100微升，然后向第二支EP管中加入3．94×10-4mol/L的Hg2+溶液5微升，向第三支EP管中加入3.94x10-4mol·L-1的Hg2+溶液5微升和一定量的GSH溶液。分別用pH6．5的Na2HP04一NaH2P04緩沖液定容到1mL，放置5min后，在激發(fā)波長為250nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5．onm下，掃描發(fā)射光譜。最佳激發(fā)波長：250nm；最佳發(fā)射波長：460nm當前第55頁\共有63頁\編于星期四\20點2結果與討論2．1緩沖溶液及其pH的選擇在最佳激發(fā)波長下，考察了不同pH值的Na2HPO4一NaH2