綠潮次生毒性的快速檢測方法-發(fā)光細菌法

綠潮次生毒性的快速檢測方法-發(fā)光細菌法范圍本標準規(guī)定了以一種發(fā)光細菌-費氏弧菌（Vibriofischeri）為受試生物的綠潮次生毒性快速檢測方法與毒性水平評價。本標準適用于綠潮發(fā)生海域綠潮藻腐爛液次生毒性的檢測。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB17378.3海洋監(jiān)測規(guī)范第3部分：樣品采集、貯存與運輸術語和定義下列術語和定義適用于本文件。綠潮次生毒性secondarytoxicityofGreentide綠潮藻腐爛分解產(chǎn)生的物質(zhì)對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的影響及損害的能力。光抑制率lightinhibitionrate水樣在一定的時間和條件下與發(fā)光細菌接觸后，發(fā)光細菌的發(fā)光量降低的百分比。光增益率lightgainrate水樣在一定的時間和條件下與發(fā)光細菌接觸后，發(fā)光細菌的發(fā)光量增加的百分比。半數(shù)效應濃度medianeffectconcentration樣品在一定的時間和條件下與發(fā)光細菌接觸后，發(fā)光細菌的發(fā)光量減少50%時的樣品濃度。水合reconstitution處于冷藏環(huán)境的發(fā)光細菌凍干粉加入一定量的稀釋劑恢復至活性。水合時間reconstitutiontime添加稀釋劑的發(fā)光細菌恢復至活性所需要的時間。反應時間reactiontime恢復至活性的發(fā)光細菌與對照樣本或者待測樣本接觸的時間。方法原理發(fā)光細菌在一定實驗條件下的發(fā)光強度是穩(wěn)定的。在一定綠潮次生污染物范圍內(nèi)，發(fā)光細菌接觸樣品后的發(fā)光強度與樣品的急性毒性水平呈顯著負相關（P<0.05），通過分析儀測定細菌發(fā)光強度的變化以表示樣品的急性毒性水平。試劑與材料發(fā)光細菌凍干粉本方法使用的發(fā)光細菌菌株為費氏弧菌（VibriofischeriNRRLB-11177）。凍干粉應在-20℃~-25℃儲存，4℃時，保存時間不應超過4周；22℃時，不應超過24h。稀釋劑稀釋劑為2%氯化鈉溶液，用作水合發(fā)光細菌凍干粉、稀釋樣品以及無毒對照樣本。應在2℃~8℃保存。宜選用與凍干粉相應的稀釋劑。參比毒物母液稱取0.05g七水合硫酸鋅（ZnSO4?7H2O、分析純）溶解于稀釋劑中，定容至500mL，即為參比毒物母液（100mg/L）。母液應密封4℃保存，保存期不應超過6個月。參比毒物標準液按照等差、等比倍數(shù)相結(jié)合的方式，采用梯度稀釋法將參比毒物母液依次稀釋至6mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L和0.25mg/L，用于測定發(fā)光強度并制作標準曲線。標準液應現(xiàn)用現(xiàn)配。儀器設備儀器和設備如下：——生物毒性分析儀；——溫度計；——離心機；——電子天平。樣品的采集、保存和預處理樣品的采集參照GB17378.3溶解氧、生化需氧量樣品采集執(zhí)行，即采樣時應注意防止攪動水體，水樣不應暴氣。應避免采集漂浮物，水樣應充滿樣品瓶，并記錄當時現(xiàn)場的水溫。樣品瓶應采用經(jīng)過滅菌的棕色玻璃瓶。樣品信息采集表參見附錄A。樣品的保存樣品采集后宜在現(xiàn)場盡快進行毒性測定。若在實驗室內(nèi)測定，樣品應在4℃保存，24h內(nèi)測定；不能在24h內(nèi)測定的，應轉(zhuǎn)入50mL凍存管內(nèi)，于-20℃避光保存，應1周內(nèi)測定。樣品的預處理渾濁的樣品應通過沉淀或使用離心機以5000r/min，離心1min后，取上清液進行毒性測試。樣品的檢測實驗室溫度的校正實驗室檢測時，應調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度與采樣地溫度接近。溫差應控制在±2℃。樣品管的準備根據(jù)樣品數(shù)量，準備相應數(shù)量的測試管：對照樣品管2×3個（3個重復），待測樣品管2n×3個（n:樣品數(shù)量）。將測試管在小試管架中平均排成兩排，第一排編碼為A1、A2、A3……An；第二排編碼為B1、B2、B3……Bn，前后兩排一一對應。注：n應小于10。發(fā)光細菌凍干粉的水合根據(jù)待測樣品的數(shù)量，從冷凍環(huán)境中取出相應數(shù)量的發(fā)光細菌凍干粉，輕敲小瓶，確保凍干細菌充分落在瓶子底部。加入稀釋劑，水合時間15min。若水合單瓶凍干粉，向每只凍干粉中添加300μL稀釋劑，用調(diào)至100μL的移液器混合3~4次；若水合多瓶凍干粉，需向每支凍干粉中加入300μL稀釋液，然后將所有水合試劑并入一個新試管中，用調(diào)至500μL的移液器混合3~4次。在等待水合過程中，可將稀釋劑、待測水樣各取1000μL分別加入A1管及A2~An管中。發(fā)光細菌初始相對發(fā)光值的測定凍干粉水合15min之后，水合液由渾濁變?yōu)榍宄?。依次向B1、B2、B3……Bn小試管中添加100μL水合液，并依次將B1……Bn放入檢測儀中進行初始相對發(fā)光值檢測。反應后發(fā)光細菌相對發(fā)光強度值測定當?shù)贐n個小試管讀數(shù)結(jié)束放回試管架后，5min反應時間倒計時開始，迅速取A列溶液900μL加到對應的B列小試管中，混勻。待反應結(jié)束后，依次對B1、B2、B3……Bn發(fā)光值讀數(shù)。標準液檢測測定同一批樣品或開始使用一批新的發(fā)光菌凍干粉試劑時均需進行毒性測定。測試步驟同8。數(shù)據(jù)處理光抑制率/光增益率的計算：光抑制率/光增益率I計算方法見公式（1）：（1）式中：So——測試樣品管初始相對發(fā)光強度值；St——測試樣品管反應5min后相對發(fā)光強度值;f——反應5min校正因子，計算方法見公式（2）：f=Ct/Co（2）式中：Co——對照樣品管初始相對發(fā)光強度值；Ct——對照樣品管反應5min后相對發(fā)光強度值。EC50的計算以I值為橫坐標，ZnSO4?7H2O濃度為縱坐標做對數(shù)趨勢線預測，得出相關系數(shù)R并計算出EC50。質(zhì)量控制——反應5min校正因子f應為0.6~1.8，否則應更換凍干粉；——15℃~35℃，反應5min標準液ZnSO4?7H2O的EC50范圍為1mg/L~10mg/L。毒性水平評價樣品毒性水平的表征方法采用反應5min發(fā)光抑制/增益率I進行評價。具體評價方法為：根據(jù)I值將毒性等級分為4級，1、2、3、4級分別為無毒性風險、低度毒性風險、中度毒性風險、高度毒性風險，分級方法見表1。測試結(jié)果報表參見附錄B。表1毒性風險等級評價方法毒性等級I毒性風險等級12I<00≤I<30%無毒性風險低度毒性風險330%≤I<80%中度毒性風險4I≥80%高度毒性風險

附錄A

（資料性附錄）樣品信息采集表樣品信息采集表見表A.1。

表A.1樣品信息采集表監(jiān)測單位：（章）填表日期：年月日共頁第頁采樣者發(fā)光菌、儀器名稱樣品編號采樣時間經(jīng)度°緯度°水溫℃保存方式運輸方式分析者校對者審核者附錄B

（資料性附錄）測試結(jié)果報表測試結(jié)果報表見表B.1。表B.1測試結(jié)果報表監(jiān)測單位：（章）