質(zhì)粒種類與應(yīng)用

質(zhì)粒種類與應(yīng)用第一頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四

基因載體是一類能自我復(fù)制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復(fù)制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細(xì)胞。常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體、病毒等第二頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四第三頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四

基因工程載體的構(gòu)建必需應(yīng)用表達(dá)調(diào)控的基本理論知識(shí)，應(yīng)用已知的調(diào)控序列進(jìn)行重組、改造。第四頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四基因載體應(yīng)具備的條件：（1）有多種限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，但每種切口最好只有1個(gè)；（2）有選擇標(biāo)記，例如抗藥性標(biāo)記，藍(lán)白斑試驗(yàn)；（3）有一定容量；（4）有相當(dāng)?shù)某緮?shù)，即每個(gè)宿主菌可能容納的最多數(shù)。第五頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker基因載體第六頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四載體的功能及特征載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件第七頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四載體的功能及特征載體應(yīng)具備的條件具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）

具有合適的篩選標(biāo)記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)第八頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒(plasmid)

Plasmid獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。

Plasmidchromosome

第九頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb第十頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒10-60拷貝stringentplasmid第十一頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制–質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合oriE.coliColE1

plasmid復(fù)制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’第十二頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制–質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep第十三頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容粒組成不相容性群第十四頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢第十五頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒可分成兩大類：接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等如Col、R的其它成員非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由bom和mob基因決定20060421第十六頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義第十七頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC101

8.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr第十八頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒來自pSC101拷貝數(shù)小于10

表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測序質(zhì)粒含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒裝有報(bào)告基因便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選第十九頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。

發(fā)展概況第二十頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四第二十一頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四

pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。把pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段，換上合用的表達(dá)組件，就可以構(gòu)建成工作所需的新載體。

許多實(shí)用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的基礎(chǔ)上改建而成?？梢娖湓唾|(zhì)粒在使用上有優(yōu)點(diǎn)。

pBR322第二十二頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四有過百個(gè)限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，一種限制性內(nèi)切酶只有單一切口的位點(diǎn)也多達(dá)數(shù)十個(gè)，幾乎具備了所有常用限制酶都能切開并插入目的基因的優(yōu)越條件。此外，pBR322DNA，被限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段大小均已知道，可以作為核酸電泳的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。第二十三頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制pBR322：氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆第二十四頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板第二十五頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四第二十六頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四第二十七頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四pUC質(zhì)粒系列

pUC質(zhì)粒系列也是在pBR322基礎(chǔ)上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和復(fù)制起始點(diǎn)。去除了pBR322的tetr區(qū)段，換用了M13噬菌體的476bp片段，含LacZ基因及其啟動(dòng)子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker.

第二十八頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四476bp片段含有E.coli的lacZ基因的5’-序列，表達(dá)半乳糖苷酶的α片段。

LacZ的上游包括乳糖操縱子上的啟動(dòng)子Plac和操縱基因O。

lacZ之內(nèi)是M13的多功能連接器。第二十九頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四三個(gè)顯著特點(diǎn)：（1）分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞含500-700個(gè)拷貝）。（2）含易于檢測是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZα，可利用-互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。（3）多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）由人工合成的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。其MCS區(qū)與M13mp噬菌體載體的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到M13mp載體，進(jìn)行DNA測序和體外突變等研究。第三十頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測序裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’第三十一頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：正選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal第三十二頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四pKO系列組成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR322的EcoRI-PvuII位點(diǎn)包括terr，.表達(dá)產(chǎn)物催化

Gal+ATPGal-1-P+ADP以14C標(biāo)記的半乳糖作底物,檢測生成的*Gal-1-P的放射性。第三十三頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四在Galk基因上游插入目的基因，根據(jù)基因表達(dá)產(chǎn)物半乳糖激酶活性，即14C-Gal-l-P的放射性，可定量估算啟動(dòng)子功能的強(qiáng)弱。如在Galk基因前插入目的基因，與無插入的空載pKO比較，并無放射活性的增強(qiáng)，則說明插入片段不存在有啟動(dòng)子。第三十四頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGEM-3Z：多拷貝裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’用于外源基因的高效表達(dá)注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等第三十五頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物是乳糖

乳糖類似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。

IPTG配合使用在基因工程可作藍(lán)白斑篩選。

LacZ基因編碼的乳糖苷酶

X-gal

藍(lán)色吲哚產(chǎn)物藍(lán)白斑試驗(yàn)（IPTG-Xgal試驗(yàn)）第三十六頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四誘導(dǎo)物

ZYX

PO

ZYX

PO乳糖第三十七頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四標(biāo)志補(bǔ)救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZ第三十八頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四X-galLacZ藍(lán)色化合物X-gal第三十九頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因C端序列LacZ酶第四十頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四基因克隆時(shí)的定向插入

插入序列兩邊的酶切口不同,插入的組件不會(huì)倒裝，保證了在其下游目的基因插入后，沿5’→3’方向正確轉(zhuǎn)錄，這種構(gòu)建方式稱為定向插入。第四十一頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四EcoRIHindIIIOri復(fù)制起點(diǎn)LacZAPRpUC19第四十二頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA：氯化銫密度梯度離心法

質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿溶法

質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡便沸水浴法

質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間第四十三頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化氯化銫密度梯度離心法：

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第四十四頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化堿溶法：

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA用無DNase的RNase去除殘余的RNA

cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA第四十五頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化沸水浴法：

用含有EDTA和TritonX-100的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁沸水浴40秒鐘離心，用無菌牙簽挑去沉淀物乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA第四十六頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋焊咝实母腥拘阅苁雇庠椿蚋咝?dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增第四十七頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。第四十八頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體的生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成

l-DNA全長48502個(gè)核苷酸l-DNA上至少有61個(gè)基因第四十九頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四l噬菌體生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNA第五十頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：

感染周期E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解第五十一頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：

感染周期體內(nèi)包裝100個(gè)左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75-105%即36-51kbDA包裝范圍為原DNA的75-105%即36-51kb第五十二頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)特性：

溶原狀態(tài)l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶原狀態(tài)，或處于裂解狀態(tài)DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶原狀態(tài)第五十三頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四λ噬菌體線性雙鏈DNA病毒，具有末端互補(bǔ)的12nt，感染細(xì)菌后粘端互補(bǔ)成雙鏈環(huán)狀。全長48531bp，含50多個(gè)基因。第五十四頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四λ噬菌體整個(gè)基因組如圖所示，可分為三個(gè)部分

①左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。②中段：長約20kb，是λDNA整合和切出，溶原生長所需的序列。③右臂：長約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的調(diào)控基因和序列、以及λDNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂包含λDNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列；對(duì)溶菌生長來說，中段是非必需的。

第五十五頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四λ噬菌體基因大致分為4個(gè)區(qū)：

結(jié)構(gòu)區(qū)A～J19個(gè)基因，編碼頭、尾部蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)區(qū),重組區(qū)

att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子、終止子和N、CI基因，O-R為裂解區(qū).

第五十六頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體第五十七頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四λ噬菌體及其組件的應(yīng)用

λ噬菌體可以容納較大的目的基因。例如用置換法可去掉長達(dá)20kb的λDNA，換入相應(yīng)長度的目的基因。

基因文庫構(gòu)建常使用λ載體；不少先進(jìn)的質(zhì)粒應(yīng)用λ組件進(jìn)行構(gòu)建。第五十八頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度插入型載體體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段大?。?-14kb（51–37）第五十九頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度取代型載體（置換型載體）體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（51–26）載體長度26kb插入片段最大裝載長度25kb（36–26）第六十頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四允許外源DNA片段替換非必須DNA片段的載體，稱為置換型載體（replacementvectors）。一般情況下，置換型載體克隆外源片段的大小范圍是9-23kb，故而該載體主要用來構(gòu)建基因組文庫。

第六十一頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四第六十二頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四第六十三頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)同時(shí)，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)除了簡單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)第六十四頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記第六十五頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記imm434imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑第六十六頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑第六十七頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：構(gòu)建琥珀密碼子的突變體

琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株第六十八頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的主要類型：插入滅活型載體Charon2、Charon6、lgt11取代型載體lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正選擇型載體lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細(xì)菌中繁殖（Spi+），這種生長抑制表型受l-DNA上的red和gam兩個(gè)基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑第六十九頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA重組分子的體外包裝：l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的第七十頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四λDNA的體外包裝是提高λ噬菌體轉(zhuǎn)染效率的有效方法在A蛋白（有終止復(fù)制功能），E蛋白（是包裝蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重組體DNA轉(zhuǎn)入頭部。第七十一頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四第七十二頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期

加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)

用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒

密度已達(dá)1013-1014/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解

超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放l-DNA

乙醇或異丙醇沉淀l-DNA

第七十三頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌

l-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量

重組l-DNA分子的篩選較為方便

重組l-DNA分子的提取較為簡便

l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)

外源基因第七十四頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四表達(dá)載體pET-5a是典型的pET載體，其組成是在載體的基本結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上加入了T7噬菌體啟動(dòng)子序列及其下游的幾個(gè)酶切位點(diǎn)。當(dāng)外源基因插入到這些酶切位點(diǎn)后，就可在特定的宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。第七十五頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四第七十六頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

M13

DNA全長6407個(gè)核苷酸M13DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)外殼蛋白分子M13

噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長

第七十七頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四M13噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長和分裂。第七十八頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四M13噬菌體的基因組為單鏈DNA，由6407的堿基組成（GenBank注冊(cè)號(hào)為V00604）?；蚪M90%以上的序列可編碼蛋白質(zhì)，共有11個(gè)編碼基因，基因之間的間隔區(qū)多為幾個(gè)堿基。較大的間隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和DNA合成的元件。M13噬菌體基因組可編碼3類蛋白質(zhì)，包括復(fù)制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ），形態(tài)發(fā)生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ），結(jié)構(gòu)蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）?；蚪MDNA為正鏈，按基因Ⅱ至基因Ⅳ方向合成，與噬菌體的mRNA序列同義。

第七十九頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四M13噬菌體顆粒為絲狀長管狀結(jié)構(gòu)，長880nm，直徑6-7nm。噬菌體顆粒的核心由2700個(gè)基因Ⅷ編碼的結(jié)構(gòu)蛋白呈管狀排列而成，成熟的基因Ⅷ的產(chǎn)物為由50個(gè)氨基酸殘基組成的α螺旋蛋白。頂端由5個(gè)基因Ⅶ和5個(gè)基因Ⅸ產(chǎn)物組成，作用于間隔區(qū)中的包裝信號(hào)。5個(gè)基因Ⅲ蛋白和5個(gè)基因Ⅵ蛋白位于絲桿的末端，參與對(duì)性纖毛的吸咐。右圖是M13噬菌體結(jié)構(gòu)模型。

第八十頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性：

感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV第八十一頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删wDNA（正鏈）在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈DNA，用于DNA的復(fù)制，因此這種雙鏈DNA稱為復(fù)制型DNA（replicativeformDNA），即RFDNA。通過θ復(fù)制方式，RFDNA進(jìn)行擴(kuò)增，基因的轉(zhuǎn)錄也隨即開始?；蚪M中的任意一個(gè)啟動(dòng)子都可以啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，單方向地終止于下游的終止子。啟動(dòng)子和終止子的位置關(guān)系使得靠近終止子的基因轉(zhuǎn)錄更頻繁。第八十二頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四單鏈DNA的酶切和連接是比較困難的，因此M13噬菌體在用作載體時(shí)是利用其雙鏈狀態(tài)的RFDNA。RFDNA很容易從感染細(xì)胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。第八十三頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13DNA載體的構(gòu)建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker第八十四頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四第八十五頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13DNA載體的特點(diǎn)：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡便被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大

但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb第八十六頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四噬菌體或病毒DNA與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病

毒基因組DNA。動(dòng)植物病毒種類繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類：單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組。第八十七頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四考斯質(zhì)粒與噬菌粒

l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5

kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，

考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時(shí)又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。第八十八頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四粘粒（cosmid）實(shí)際是質(zhì)粒的衍生物，是帶有cos序列的質(zhì)粒。cos序列是噬菌體DNA中將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需的DNA序列。粘粒的組成包括質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（colE1），抗性標(biāo)記（ampr），cos位點(diǎn)，因而能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。它的大小一般5-7kb左右，用來克隆大片段DNA，克隆的最大DNA片段可達(dá)45kb。有的粘粒載體含有兩個(gè)cos位點(diǎn)，在某種程度上可提高使用效率。

第八十九頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31-45kb第九十頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞第九十一頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒載體的特點(diǎn)：噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA第九十二頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒載體：pUC118/119pUC118pUC18+M13間隔區(qū)IGpUC119pUC19+M13間隔區(qū)IG500個(gè)拷貝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/119表示M13輔助噬菌體DNA第九十三頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒載體：pBluescript體外轉(zhuǎn)錄載體pBluescript=pUC+f1-ori+PT3

+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌體啟動(dòng)子PT3和PT7強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄提取出來的單鏈DNA重組分子在噬菌體RNA聚合酶的存在下，又可實(shí)現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄第九十四頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四人們?cè)O(shè)計(jì)出一些多功能的質(zhì)粒載體，這類質(zhì)粒載體有多克隆位點(diǎn)、α-互補(bǔ)、噬菌體啟動(dòng)子和單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制與包裝信號(hào)。典型的這類質(zhì)粒有pBluescriptⅡKS（±），這類質(zhì)粒一般由4個(gè)質(zhì)粒組成一套系統(tǒng)，其差別在于多克隆位點(diǎn)方向相反（根據(jù)多克隆位點(diǎn)兩端KpnⅠ和SacⅠ的順序，用KS或SK表示），或單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制啟始方向相反（或者說，引導(dǎo)DNA雙鏈中不同鏈合成單鏈DNA，用+或-表示）。pBluescriptⅡKS（±）的多克隆位點(diǎn)與pUC18/19的不同，且使用f1噬菌體的復(fù)制與包裝信號(hào)序列。

第九十五頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四人造染色體載體

人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：細(xì)菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC）第九十六頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四人造染色體載體細(xì)菌人造染色體（BacterialArtificialChromosomesBAC）細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50-300

kb之間各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝pBACs主要適用于：克隆大型基因簇（genecluster）結(jié)構(gòu)構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫第九十七頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四F質(zhì)粒大腸桿菌的F因子是一個(gè)約100kb的質(zhì)粒。它編碼60多種參與復(fù)制、分配和接合過程的蛋白質(zhì)（WillettsandSkurray，1987）。雖然F因子通常以雙鏈閉環(huán)DNA（1-2個(gè)拷貝/細(xì)胞）的形式存在，但它可以在大腸桿菌染色體中至少30個(gè)位點(diǎn)處進(jìn)行隨機(jī)整合（Low，1987）。攜帶F因子的細(xì)胞，或以游離狀態(tài)或以整合狀態(tài)表達(dá)三根發(fā)樣狀的F菌毛。F菌毛為供體與受體細(xì)胞之間產(chǎn)生性接觸所必需。

第九十八頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四細(xì)菌人工染色體是基于大腸桿菌的F質(zhì)粒構(gòu)建的，高通量低拷貝的質(zhì)粒載體。每個(gè)環(huán)狀DNA分子中攜帶一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記，一個(gè)來源于大腸桿菌F因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子oriS（Shizuyaetal.1992），一個(gè)易于DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動(dòng)的解旋酶（（RepE）以及三個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座（parA,parB,和parC）。BAC載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產(chǎn)生，減小外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作用。

第九十九頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四20060424第一百頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四真核生物載體第一百零一頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四電穿孔技術(shù)是利用脈沖電場改變細(xì)胞膜的狀態(tài)和通透性，達(dá)到將DNA導(dǎo)入細(xì)胞以及促使細(xì)胞發(fā)生融合的目的。該技術(shù)目前一方面應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，另一方面應(yīng)用于細(xì)胞融合制備雜交細(xì)胞和動(dòng)物克隆等。第一百零二頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四顯微注射技術(shù)將外源DNA注入細(xì)胞第一百零三頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四基因槍技術(shù)是一種將核酸直接發(fā)送至細(xì)胞內(nèi)的物理學(xué)方法。PDS-1000/H臺(tái)式基因槍可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的原位轉(zhuǎn)導(dǎo)；

應(yīng)用于包括培養(yǎng)細(xì)胞、組織、器官、植物、動(dòng)物、細(xì)菌和細(xì)胞器官等各種不同的目標(biāo)。

第一百零四頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四穿梭載體（Shuttlevector）是能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體。如有些載體既能在原核細(xì)胞中復(fù)制又能在真核細(xì)胞中復(fù)制，或能在E.coli中復(fù)制又能在革蘭氏陽性細(xì)菌中復(fù)制。這類載體主要是質(zhì)粒載體。

第一百零五頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四酵母附加型質(zhì)粒2um質(zhì)粒是非常好的克隆載體，它有6kb大小，在酵母細(xì)胞中的拷貝數(shù)在70-200之間，利用質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制，許多酶由寄主細(xì)胞提供，質(zhì)粒中含有編碼蛋白質(zhì)的基因REP1,REP2。2um質(zhì)粒的問題：選擇標(biāo)記的問題。在實(shí)踐中，利用酵母的正常的基因，一般是編碼氨基酸合成的酶，如LEU2基因編碼β-異丙基蘋果酸脫氫酶，參與丙酮酸向亮氨酸的轉(zhuǎn)化。為了利用LEU氨酸作為選擇標(biāo)記，需要用到一種特殊的寄主，寄主必須是LEU-2營養(yǎng)缺陷體這樣的寄主只有在添加亮氨酸的條件下才能生長。質(zhì)粒中含有LEU-2合成基因，可以在基本培養(yǎng)基上生長。第一百零六頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四第一百零七頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四以2um質(zhì)粒為基礎(chǔ)的載體—酵母附加質(zhì)粒來自于2um質(zhì)粒的載體稱為酵母附加載體或者YEps。YEps可以含有完整的2um質(zhì)粒，也可以只含有2um質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，如YEp13以后的類型。YEp13是一個(gè)穿梭質(zhì)粒，含有2um質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和選擇基因LEU2,YEp13還包含pBR322的完整序列，因此可以在大腸桿菌也可以在酵母中進(jìn)行選擇。第一百零八頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四YEp的結(jié)構(gòu)第一百零九頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四YEp整合到酵母染色體上第一百一十頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農(nóng)桿菌感染，而產(chǎn)生根瘤。它是一種革蘭氏陰性土壤桿菌（A.tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）質(zhì)粒介導(dǎo)的。第一百一十一頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四農(nóng)桿根瘤菌之所以會(huì)感染植物根部是因?yàn)橹参锔繐p傷部位分泌出酚類物質(zhì)乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質(zhì)可以誘導(dǎo)Vir（Virulenceregion)基因的啟動(dòng)表達(dá)，Vir基因的產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的一段T－DNA單鏈切下，而位于根瘤染色體上的操縱子基因產(chǎn)物則與單鏈T－DNA結(jié)合，形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。T－DNA上有三套基因，其中兩套基因分別控制合成植物生長素與分裂素，促使植物創(chuàng)傷組織無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。第三套基因合成冠癭堿，冠癭堿有四種類型：章魚堿（octopine）、胭脂堿（nopaline）、農(nóng)桿堿（agropine）、琥珀堿（succinamopine），使農(nóng)桿菌生長必需的物質(zhì)。第一百一十二頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四Ti質(zhì)粒大約在160～240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。Vir基因區(qū)在36kb左右。除此之外，Ti質(zhì)粒上還存在Con區(qū)（regionencodingconjugation)和Ori區(qū)（originofreplication)。T-DNA上共有三套基因和左右兩個(gè)邊界，LB和RB是長為25bp的末端反復(fù)重復(fù)順序，在切除及整合過程具有重要意義。

第一百一十三頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四T-DNA切除由Vir區(qū)編碼的特異性內(nèi)切酶完成，分別在LB和RB的第三個(gè)堿基和第四個(gè)堿基之間產(chǎn)生缺口，并形成單鏈T-DNA。T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不對(duì)稱的，RB順序與整合有關(guān)，而LB無關(guān)。T-DNA的整合可以是單拷貝的，也可以是多拷貝的，成串聯(lián)形式排列，但整合位點(diǎn)的特異性尚未確定。第一百一十四頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的共整合系統(tǒng)

T-DNA克隆在大腸桿菌質(zhì)粒上，含有E.coli的選擇標(biāo)記和植物選擇標(biāo)記Kmr。首先在E.coli中篩選重組分子，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti質(zhì)粒上，用于侵染植物細(xì)胞。T-DNA重組分子整合到植物細(xì)胞染色體DNA上，Kmr篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。第一百一十五頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的雙元系統(tǒng)目前T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法是雙元系統(tǒng)，即穿梭質(zhì)粒。插入外源基因的重組穿梭質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化含有Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌，經(jīng)篩選后直接感染植物細(xì)胞。與共整合系統(tǒng)所不同的是，含外源基因的質(zhì)?？稍谵r(nóng)桿菌內(nèi)自主復(fù)制并保留下來。農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，植物的創(chuàng)傷信號(hào)啟動(dòng)Ti質(zhì)粒上的Vir基因，隨后將穿梭質(zhì)粒的T-DNA切割下來，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。第一百一十六頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四第一百一十七頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四典型的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)典型的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是利用大腸桿菌中位點(diǎn)特異的轉(zhuǎn)座或昆蟲細(xì)胞中的同源重組來產(chǎn)生重組桿狀病毒。這些過程要求大量的操作時(shí)間，周期長達(dá)幾周。BaculoDirect?桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)簡化了這些過程，節(jié)省了大量時(shí)間，使你可以比以往任何時(shí)候更快地獲得桿狀病毒表達(dá)結(jié)果。

第一百一十八頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四BaculoDirect?系統(tǒng)利用快速、簡便的Gateway?技術(shù)。BaculoDirect?線性DNA包含了attR位點(diǎn)，允許與包含有目的基因的Gateway?入門克隆進(jìn)行有效的重組。將entry克隆、BaculoDirect?線性DNA和Gateway?LRClonase?酶混合物稍加混勻，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)即可。最終的反應(yīng)混和物中包含有攜帶目的基因的桿狀病毒，可以直接用于轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞（sf9或sf21）。第一百一十九頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四SV40病毒作為載體第一百二十頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒載體是常用的病毒載體之一。反轉(zhuǎn)錄病毒的DNA基因組的兩端各有一個(gè)長末端重復(fù)序列(5‘—LTR和3’—LTR)，有一個(gè)包裝病毒顆粒時(shí)必需的非編碼序列ψ+，同時(shí)有三個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因gag、pol和env。反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以容納外源DNA的長度在10kb左右，以很高的轉(zhuǎn)染率感染宿主細(xì)胞，特別是分裂中的細(xì)胞。轉(zhuǎn)入宿主的細(xì)胞后，反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨即整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，這種整合的位點(diǎn)是隨機(jī)的。第一百二十一頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四反轉(zhuǎn)錄病毒載體在構(gòu)建時(shí)，刪去了poi、env基因和gag基因的3’端，但保留了病毒顆粒所需的ψ+序列。其目的是在于提高載體的安全性，防止反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后進(jìn)行增殖并包裝成病毒顆粒對(duì)宿主細(xì)胞造成可能的傷害。這樣，在制備反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，就必須有一個(gè)輔助細(xì)胞系，這種細(xì)胞內(nèi)有缺陷型病毒可以提供包裝用的外殼蛋白，但自身沒有包裝信號(hào)。這樣，反轉(zhuǎn)錄病毒載體就可利用這些外殼蛋白包裝成病毒顆粒在輔助細(xì)胞系內(nèi)大量擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄病載體多半用于基因治療，由于病毒載體在宿主細(xì)胞基因組上隨機(jī)插入，人們擔(dān)心會(huì)引起不安全的后果，這種載體還在不斷改進(jìn)之中。第一百二十二頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四YAC人工染色體載體是利用釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，其工作環(huán)境也是在釀酒酵母中。釀酒酵母的形態(tài)為扁圓形和卵形，生長的代時(shí)為90分鐘；含16條染色體，其大小為225-1900kb，總計(jì)有14×106bp；具真核mRNA的加工活性。

第一百二十三頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四人造染色體載體酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）YAC載體應(yīng)含有下列元件：

酵母染色體的端粒序列

酵母人造染色體的構(gòu)建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色體的復(fù)制子

酵母染色體的中心粒序列

酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記大腸桿菌的復(fù)制子

大腸桿菌的選擇標(biāo)記YAC載體的裝載量為350-400kb第一百二十四頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四人造染色體載體酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）酵母人造染色體的使用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI連接轉(zhuǎn)化酵母菌重組酵母染色體第一百二十五頁，共一百三十八頁，編輯于2023年，星期四pYAC4：當(dāng)用BamHⅠ切割成線狀后，就形成了一個(gè)微型酵母染色體，包含染色體復(fù)制的必要順式元件，如自主復(fù)制序列、著絲粒和位于兩端的端粒。這些元件在酵母菌中可以驅(qū)動(dòng)染色體的復(fù)制和分配，從而決定這個(gè)微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的DNA片段。YAC載體的原理性工作流程：對(duì)于BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色體，當(dāng)用EcoRⅠ或SmaⅠ切割抑制基因sup4內(nèi)部的位點(diǎn)后形成染色體的兩條臂，與外源大片段DNA在該切點(diǎn)相連就形成一個(gè)大型人工酵母染色體，通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入到酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂分配到子細(xì)胞中去，達(dá)到克隆大片段DNA的目