高二班《基因工程的基本操作程序》

限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)切酶Ⅱ的識別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。在質(zhì)粒上有酶Ⅰ的一個切點(diǎn)，在目的基因的兩側(cè)各有1個酶Ⅱ的切點(diǎn)。①請畫出質(zhì)粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。②請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。③在DNA連接酶的作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接起來？為什么？p53基因是一種抑癌基因，在惡性腫瘤患者中突變率達(dá)50%以上。與人相比，大象體內(nèi)含有多對p53基因，推測是其很少患腫瘤的主要原因。設(shè)計實驗探究人p53基因在乳腺腫瘤細(xì)胞中的作用?；卮鹣铝袉栴}：

（1）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增p53基因。首先根據(jù)p53基因的核苷酸序列，設(shè)計并合成__________，其能與變性p53基因單鏈結(jié)合，在__________催化作用下延伸，如此循環(huán)多次。（2）p53基因表達(dá)載體的構(gòu)建。如圖所示，表達(dá)載體上除了標(biāo)注的DNA片段外，在p53基因上游還必須擁有的DNA片段（箭頭所示）是____________，其作用機(jī)理是__________。外源p53基因插入載體中至少需要兩種工具酶，包括準(zhǔn)確切割DNA的限制性核酸內(nèi)切酶和將雙鏈DNA片段“縫合”起來的__________。原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有啟動子，下游有終止子啟動子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫中獲取（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成例如：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、植物抗病基因等1、從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫?；蛭膸?/p>

基因組文庫部分基因文庫(CDNA文庫)基因文庫

基因組文庫部分基因文庫(CDNA文庫)某生物體內(nèi)全部DNA

許多DNA片段受體菌群體基因組文庫的構(gòu)建限制酶與運(yùn)載體連接導(dǎo)入基因組文庫某種生物某個時期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運(yùn)載體連接導(dǎo)入部分基因文庫（cDNA文庫）cDNA文庫的構(gòu)建③基因組文庫和部分基因文庫比較（3）如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR——多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加，可獲取大量的目的基因。PCR技術(shù)原理：前提：原料：方式DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n一段已知目的基因的核苷酸序列（DNA模板）引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）

過程：“變性、退火、延伸”三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對和結(jié)合延伸：加熱至70～75℃以目的基因為模板，合成互補(bǔ)的新DNA鏈變性退火延伸逆轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA雙鏈DNA（目的基因)化學(xué)合成法蛋白質(zhì)的氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因人工合成逆轉(zhuǎn)錄酶3、人工合成目的基因推測推測單鏈DNADNA聚合酶cDNA合成過程

第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。1、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是①從基因文庫中獲取目的基因②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因③反轉(zhuǎn)錄法④通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③D3、目的基因主要是指_______________的結(jié)構(gòu)基因。獲得目的基因的常見方法有三種：（1）從基因文庫中獲取目的基因，根據(jù)基因的_________序列，基因在________上的位置，基因的________產(chǎn)物mRNA，基因的_______產(chǎn)物蛋白質(zhì)等獲取目的基因。（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，該技術(shù)是一項在________完成的核酸合成技術(shù)，前提條件是有一段已知目的基因的________序列，以便于合成_________。（3）如果基因較小且核苷酸序列已知，可以通過____________方法。編碼蛋白質(zhì)核苷酸染色體轉(zhuǎn)錄表達(dá)體外核苷酸引物人工合成基因表達(dá)載體的作用：a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心不可以。因為目的基因在表達(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；（5）有時需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。2、基因表達(dá)載體的組成：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因它們各自的作用是什么?啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。（2）用___________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1.過程:1、下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的是A．啟動子是與RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，是起始密碼子B．啟動子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C．標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因從而便于篩選D．基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別A2、目前轉(zhuǎn)基因工程可以A.打破地理隔離但不能突破生殖隔離B.打破生殖隔離但不能突破地理隔離C.完全突破地理隔離和生殖隔離D.部分突破地理隔離和生殖隔離C(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：動植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。轉(zhuǎn)化——目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)2023/6/1430方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——

感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞311、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點(diǎn):能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（2）基因槍法基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞①方法：顯微注射法②程序：目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA1、基因工程中科學(xué)家常用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是A．結(jié)構(gòu)簡單、操作方便B．繁殖速度快C．遺傳物質(zhì)含量少、簡單D．性狀穩(wěn)定、變異少2、基因工程常用的受體細(xì)胞有①大腸桿菌②枯草桿菌③支原體④動植物細(xì)胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④BD3、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計施工的，在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的步驟是A.人工合成基因B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D.目的基因的檢測和表達(dá)C4.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是①將毒素蛋白質(zhì)注射到棉受精卵中②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵中④將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)A．①②B．②③C．③④D．①④C5.下列屬于基因工程中導(dǎo)入目的基因方法的是①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法②基因槍法③花粉管道法④顯微注射法⑤胚胎移植⑥D(zhuǎn)NA分子雜交法A．①②③④⑤⑥B．①②③④⑤C．①②③④D．①③④⑤⑥C(四)目的基因的檢測與鑒定檢測①導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞方法——DNA分子雜交②表達(dá)檢測轉(zhuǎn)錄檢測——分子雜交翻譯檢測——抗原抗體雜交分子檢測法鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等個體水平的鑒定知識延伸——DNA分子雜交技術(shù)該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。返回1、用β-珠蛋白的DNA探針可以檢測出的遺傳病是A．鐮刀狀細(xì)胞貧血癥B．白血病C．壞血病D．苯丙酮尿癥A2、應(yīng)用基因工程技術(shù)診斷疾病的過程中必須使用基因探針才能達(dá)到檢測疾病的目的。這里的基因探針是A．用于檢測疾病的醫(yī)療器械B．用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的DNA分子C．合成β-珠蛋白的DNAD．合成苯丙羥化酶的DNA片段B思考與探究：2.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。3.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的β-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計？（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA)。（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達(dá)載體。（3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。（4）培養(yǎng)進(jìn)入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取β-珠蛋白。復(fù)習(xí)題1）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞有哪些方法?(試舉例說明)2）簡述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完