腫瘤細(xì)胞與分化凋亡一

腫瘤細(xì)胞與分化凋亡一第一頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三前言大量研究證明，腫瘤的發(fā)生是多因素、多階段、多基因共同作用的結(jié)果。其特點(diǎn)是多因素（環(huán)境因素，如物理、化學(xué)、生物等；機(jī)體因素，如遺傳、免疫、年齡與性別等）交互作用，有的起致癌作用，即誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，有的起促癌作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展經(jīng)歷了啟動(dòng)、促發(fā)、侵襲、轉(zhuǎn)移等階段。并且，各階段都可能發(fā)生多種癌基因激活、抑癌基因失活。表現(xiàn)為增生過(guò)度、分化異常、凋亡受阻。第二頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三長(zhǎng)期以來(lái)，“細(xì)胞一旦癌變后，就永遠(yuǎn)是癌細(xì)胞”的觀點(diǎn)一直統(tǒng)治著腫瘤學(xué)領(lǐng)域，即惡性腫瘤是不能逆轉(zhuǎn)的。在這種思想指導(dǎo)下，傳統(tǒng)的腫瘤治療不外乎外科手術(shù)切除、化療、放射或免疫治療。1971年，F(xiàn)riend報(bào)告小鼠紅白血病細(xì)胞（MEL）可被二甲基亞砜（DMSO）誘導(dǎo)分化，開(kāi)創(chuàng)了腫瘤細(xì)胞分化研究的先河。目前，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的已經(jīng)成為重要研究前沿。細(xì)胞分化與腫瘤第三頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三一、腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化的有關(guān)概念

1.分化(differentiation）

細(xì)胞分化是指幼稚的胚胎細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育為各種不同形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能代謝的成熟細(xì)胞的過(guò)程。如人起源于一個(gè)受精卵，通過(guò)細(xì)胞分裂形成內(nèi)、中、外三個(gè)胚層細(xì)胞。第四頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.反分化(retro-differentiation)

又稱去分化(dedifferentiation)，腫瘤的反分化是指細(xì)胞惡變后，細(xì)胞的多種表型又回到胚胎細(xì)胞表型的現(xiàn)象。惡性腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)分化異常，不成熟。第五頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三3.再分化（redifferentiation）

又稱逆轉(zhuǎn)（reversion），它是指在分化誘導(dǎo)劑的作用下，惡性腫瘤細(xì)胞被誘導(dǎo)而重新向正常細(xì)胞的方向演變分化，表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)等諸多指標(biāo)均向正常細(xì)胞接近，甚至完全轉(zhuǎn)變?yōu)檎＜?xì)胞。第六頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三二、分化誘導(dǎo)劑1.內(nèi)源性分化誘導(dǎo)劑

內(nèi)源性分化誘導(dǎo)劑是由腫瘤或宿主細(xì)胞產(chǎn)生的具有分化誘導(dǎo)作用的化學(xué)物質(zhì)。它有以下幾種：⑴集落刺激因子（CSF）：分為CSF-M和CSF-G；⑵粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞分化因子（GM－DF）；⑶類固醇類化合物：如糖皮質(zhì)激素和1，25-（OH）2-vitD3；⑷細(xì)胞因子:如TNF-α和INF-γ；⑸糖脂:如神經(jīng)節(jié)苷脂GM3；⑹其它，如cAMP等。第七頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.外源性分化誘導(dǎo)劑

可分為以下幾類：⑴無(wú)機(jī)化合物：亞硒酸鈉等。⑵簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物：正丁酸、二甲基亞砜(DMSO)、六次甲基二乙酰胺(HMBA)等。⑶維生素A類化合物：維甲酸、AM80、芳維甲等。⑷佛波酯類化合物：12-O-十四酯酰佛波-13-乙酸(TPA)。⑸抗生素類：放線菌素D、絲裂霉素等；⑹抗癌藥：6-巰基嘌呤、5-氮胞嘧啶等。第八頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三三、誘導(dǎo)腫瘤分化的研究

1.體外分化誘導(dǎo)模型(1)白血病細(xì)胞分化誘導(dǎo)模型

最常用的是急性髓性白血病細(xì)胞株HL-60。它在分化誘導(dǎo)劑作用下可出現(xiàn)分化表型如形態(tài)上由早幼粒白血病細(xì)胞分化為中、晚幼粒、桿狀核細(xì)胞和分葉核細(xì)胞，生化方面出現(xiàn)硝基藍(lán)四氮唑還原性（NBT），功能方面出現(xiàn)吞噬活性及趨化性，生物學(xué)方面喪失了在軟瓊脂培養(yǎng)基上形成集落及裸鼠體內(nèi)移植成活的能力。第九頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

(2)實(shí)體瘤分化誘導(dǎo)模型

人胃癌分化誘導(dǎo)模型國(guó)內(nèi)外有人用DMSO、HMBA、suramin、維甲酸、大蒜油及大蒜與其烯丙基硫化合物等處理胃癌細(xì)胞株時(shí)，癌細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能代謝和生物學(xué)等方面均出現(xiàn)分化特征。

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

在正丁酸、苯丁酸及其鹽類作用后，瘤細(xì)胞可形成樹(shù)突狀結(jié)構(gòu)，功能上能產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)合成酶，生物學(xué)上其致瘤性明顯降低，表現(xiàn)出分化的特點(diǎn)。第十頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

人粘液表皮樣癌分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

MEC-1細(xì)胞是上皮樣細(xì)胞，體外增殖迅速，形態(tài)異型性明顯，裸鼠體內(nèi)成瘤性，在HMBA的作用下出現(xiàn)分化表型：生長(zhǎng)抑制、核異型性降低、表面微絨毛減少、胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增加和出現(xiàn)特征性的成熟分泌顆粒、DNA含量減少及倍體趨向二倍體等。

其它實(shí)體瘤分化誘導(dǎo)模型其它實(shí)體瘤如黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌等均有報(bào)道。第十一頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

2.體內(nèi)分化誘導(dǎo)模型

目前，體內(nèi)分化誘導(dǎo)尚無(wú)理想的模型。人白血病細(xì)胞一般采用小鼠腹腔擴(kuò)散法及裸鼠皮下移植法;人實(shí)體瘤采用小鼠腎包膜下移植和裸鼠移植建立分化誘導(dǎo)模型。分化誘導(dǎo)效果主要根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)抑制和荷瘤鼠生命延長(zhǎng)，細(xì)胞標(biāo)記酶、抗原以及形態(tài)的變化來(lái)判斷。國(guó)內(nèi)用NB4細(xì)胞株建立了SCID小鼠人APL腹水細(xì)胞模型，在ATRA作用下能發(fā)生分化，如明顯提高NBT還原率和CD11b的表達(dá)，小鼠的生存期明顯延長(zhǎng)。該模型的建立是評(píng)價(jià)新的或已有的治療APL藥物和臨床前期實(shí)驗(yàn)研究的理想模型。第十二頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三3.分化誘導(dǎo)的臨床試驗(yàn)

盡管誘導(dǎo)分化研究取得了成績(jī)，但其最終目的是能應(yīng)用于臨床，ATRA治療APML能有效地達(dá)到臨床緩解，被認(rèn)為是人類惡性腫瘤分化治療的成功典范。ATRA能誘導(dǎo)APL病人惡性腫瘤細(xì)胞分化成熟，口服ATRA可使大多數(shù)患者達(dá)到完全臨床緩解，即使是傳統(tǒng)化療失敗后亦是如此。在歐洲的隨機(jī)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ATRA加化療比單用化療方案能明顯降低復(fù)發(fā)率和延長(zhǎng)生存期。第十三頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三四、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制1.核內(nèi)受體途徑維甲類化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化主要通過(guò)核內(nèi)受體途徑。維甲酸受體(RAR)是廣泛存在各種組織細(xì)胞核內(nèi)的一類受體蛋白，有RARS和RXRS兩類，每一類又有α、β、γ三種類型，比較其DNA序列和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，二者屬于類固醇-甲狀腺素-vitD3受體在內(nèi)的核內(nèi)受體超家族。在細(xì)胞液內(nèi)存在RA結(jié)合蛋白，能將RA從細(xì)胞漿運(yùn)輸?shù)胶藘?nèi)染色體上的受體部位，自身則釋放回到胞漿。RA經(jīng)胞質(zhì)內(nèi)RA結(jié)合蛋白運(yùn)輸?shù)饺旧w上的受體部位，與核受體以二聚體形式結(jié)合某些靶序列，進(jìn)而引起特定基因的轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞分化。第十四頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

Manfredini等用ATRA和vitD3誘導(dǎo)白血病母細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，M0、M1對(duì)二者不敏感，M3在ATRA誘導(dǎo)下向粒細(xì)胞方向分化，M2則在二者誘導(dǎo)下向單核細(xì)胞分化。進(jìn)一步研究方發(fā)現(xiàn)，ATRA和vitD3有效地增加核內(nèi)VDR，VDR與RXR形成二聚體，再結(jié)合到DR3型VD反應(yīng)元件，從而激活VD反應(yīng)元件調(diào)控的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)了M2向單核細(xì)胞方向分化。第十五頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

2.影響基因轉(zhuǎn)錄Naka等用9-cis-維甲酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株分化研究中，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)胃癌細(xì)胞株能合成RARs和RXRsmRNA，其中一些細(xì)胞株并不停滯于G0/G1期，但可一過(guò)性增加p21WAF1蛋白表達(dá)，降低CDK7、EGFR及cyclinD蛋白量，減少Rb基因產(chǎn)物磷酸化。認(rèn)為9-cis-維甲酸抑制細(xì)胞生長(zhǎng)是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期，影響維甲酸受體mRNA轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)的。第十六頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

Okabe發(fā)現(xiàn)TPA可誘導(dǎo)Ph’陽(yáng)性白血病細(xì)胞MC3向巨核細(xì)胞系分化，血小板糖蛋白GPⅡb表達(dá)增強(qiáng)，GPⅡbmRNA水平增高，處理組有GATA-1表達(dá)，而GATA-3不表達(dá)，未處理組僅GATA-2轉(zhuǎn)錄。TPA則通過(guò)影響GPⅡb及GATAs轉(zhuǎn)錄來(lái)誘導(dǎo)MC3細(xì)胞分化。Garingo在誘導(dǎo)MEL分化中發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞特異性基因轉(zhuǎn)錄活化，PKA缺陷時(shí)則轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)障礙。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2是提高球蛋白位點(diǎn)控制區(qū)活性的必須成分。DNA與NF-E2結(jié)合，α-球蛋白位點(diǎn)控制區(qū)增強(qiáng)子活性在PKA缺陷細(xì)胞中明顯低于具有PKA活性的細(xì)胞，PKA對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控影響了紅細(xì)胞特異基因轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化。第十七頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三研究表明，染色質(zhì)重塑在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中有重要作用，而組蛋白乙?；?、去乙?；揎検怯绊懭旧|(zhì)重塑的重要因素。我們前期研究的基礎(chǔ)上，建立人胃癌MGC803細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，以被證實(shí)有顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的藥物丁酸鈉（Sodiumbutyrate,SB）為陽(yáng)性對(duì)照，觀察DADS（diallyldisulfide）在體內(nèi)外誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞分化時(shí)，對(duì)其核組蛋白乙?；磉_(dá)的調(diào)控作用，以及二者之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討DADS對(duì)MGC803細(xì)胞抑制和誘導(dǎo)分化的作用機(jī)理。第十八頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

H3β-actinDADS(mg·L-1):─153060─30SB(mM):────55DADS對(duì)體外培養(yǎng)MGC803細(xì)胞組蛋白乙?；挠绊?/p>

第十九頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三H4β-actinDADS(mg·L-1):─153060─30SB(mM):────55DADS對(duì)體外培養(yǎng)MGC803細(xì)胞組蛋白乙酰化的影響

第二十頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三p21WAF1β-actin

處理時(shí)間（h）:12h24h12h24h12h24h12h24hDADS(mg·L-1):00151530306060DADS對(duì)MGC803細(xì)胞p21WAF1蛋白表達(dá)的影響

第二十一頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三DADS對(duì)各組移植瘤組織中乙?；M蛋白表達(dá)的影響

H3β-actin各處理因素：NSSBDADSDADSDADS濃度(mg·kg-1)：—6650100200

第二十二頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三H4β-actin各處理因素：NSSBDADSDADSDADS濃度(mg·kg-1)：—6650100200

第二十三頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三DADS對(duì)移植瘤細(xì)胞p21WAF1表達(dá)的影響p21WAF1β-actin各處理因素：NSSBDADSDADSDADS濃度(mg·kg-1)：—6650100200第二十四頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三3.對(duì)癌基因和抑癌基因的影響

細(xì)胞的基因控制細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，而這些基因的變化則影響基因的表達(dá)或功能被認(rèn)為是癌變的主要原因。Ras基因在細(xì)胞內(nèi)有H-，K-，N-Ras，編碼分子量為21kd的蛋白，p21Ras蛋白具有GTP酶活性。Ras能使3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，促使細(xì)胞增殖。C-myc過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞分裂，與腫瘤的形成關(guān)系密切。P53基因編碼P53蛋白，P53蛋白有野生型和突變型，野生型P53基因具有抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的作用。

第二十五頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

李曉光等用大蒜油誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞分化和凋亡研究中，發(fā)現(xiàn)處理組細(xì)胞形態(tài)接近正常細(xì)胞，細(xì)胞的致瘤性明顯下降，Northern雜交有P53和P21表達(dá)增強(qiáng)，提示大蒜油通過(guò)促進(jìn)抑癌基因P53、P21的表達(dá)，抑制細(xì)胞惡性增殖、誘導(dǎo)凋亡和促進(jìn)細(xì)胞分化。王代樹(shù)等用HMBA誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞分化時(shí)發(fā)現(xiàn)C-myc和C-H-ras表達(dá)抑制。Naka用9-順-維甲酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞分化時(shí)則有P21蛋白一過(guò)性增加。這些基因在誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化過(guò)程中的改變進(jìn)一步影響其調(diào)控的基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)瘤細(xì)胞分化的效應(yīng)。第二十六頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三我們發(fā)現(xiàn)，DADS作用下，MGC803細(xì)胞明顯抑制，且呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系；瘤細(xì)胞對(duì)ConA的凝集率、集落形成率與ALP比活性下降；瘤細(xì)胞異形性降低，核漿比下降，細(xì)胞表面微絨毛數(shù)目減少，胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富，胞核及部分細(xì)胞器呈退行性變，可見(jiàn)細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)；細(xì)胞骨架蛋白合成增加與重組，細(xì)胞間縫隙連接通訊功能恢復(fù)，提示DADS可誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞分化。DADS處理后的MGC803細(xì)胞S期細(xì)胞含量減少，G2期細(xì)胞含量增加，細(xì)胞停滯于G2期，p21WAF1、Rb表達(dá)增強(qiáng)，p21ras、c-Myc、突變型p53表達(dá)減弱。

第二十七頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

MTT比色實(shí)驗(yàn)結(jié)果第二十八頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三.DADS對(duì)MGC803細(xì)胞生長(zhǎng)的影響第二十九頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三倒置顯微鏡觀察MGC803細(xì)胞（×20）DADS組（×20）第三十頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三普通光鏡觀察

MGC803細(xì)胞HE（×20）DADS處理組HE（×20）第三十一頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三電鏡觀察

微絨毛是良惡性細(xì)胞區(qū)分的重要標(biāo)志之一，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)透射電鏡和ConA凝集性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MGC803細(xì)胞在DADS處理后，細(xì)胞表面微絨毛明顯減少，對(duì)ConA的凝集率下降，表明MGC803細(xì)胞生物學(xué)行為表現(xiàn)出惡性性下降。未處理組MGC803細(xì)胞核漿比例大，核仁均質(zhì)，以1-2個(gè)核仁細(xì)胞為主；胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器稀少，細(xì)胞分化程度低。DADS處理的MGC803細(xì)胞表面微絨毛減少，細(xì)胞核漿比例下降，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，有散在的核糖體，細(xì)胞核和線粒體水腫退變，細(xì)胞之間有腺腔結(jié)構(gòu)形成并可見(jiàn)細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)，細(xì)胞分化好。第三十二頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三第三十三頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三MGC803細(xì)胞核漿比例大，核畸形，線粒體水腫（5000倍）第三十四頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三圖示DADS組細(xì)胞電鏡結(jié)構(gòu)第三十五頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三圖示DADS組細(xì)胞電鏡結(jié)構(gòu)第三十六頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

結(jié)構(gòu)的破壞及功能的抑制都是細(xì)胞轉(zhuǎn)化早期的異常表現(xiàn)，并與細(xì)胞增殖失控及其它惡性行為有關(guān)，而微管解聚與DNA合成的啟動(dòng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中觀察到DADS處理后，MGC803細(xì)胞出現(xiàn)微絲微管合成增加與重組裝，呈現(xiàn)規(guī)則的放射狀分布，提示瘤細(xì)胞惡性表型下降，表現(xiàn)為去惡化。第三十七頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三MGC803細(xì)胞骨架考馬絲亮藍(lán)染色（×20）DADS組細(xì)胞骨架考馬絲亮藍(lán)染色（×20）第三十八頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察MGC803細(xì)胞骨架呈彌散熒光間接免疫熒光染色（×100）DADS組細(xì)胞骨架陽(yáng)性，呈黃綠色熒光環(huán)繞胞核。間接免疫熒光染色（×100）第三十九頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

劃痕標(biāo)記后數(shù)分鐘即可觀察到黃色熒光傳播，人胃癌MGC-803細(xì)胞不顯示熒光染料的傳播，表明無(wú)間縫隙連接通訊功能。DADS處理后，黃色熒光分布在傷沿細(xì)胞列和相鄰的數(shù)列細(xì)胞內(nèi)，熒光強(qiáng)度從傷沿細(xì)胞列到臨近數(shù)列細(xì)胞逐漸減弱，以傷沿細(xì)胞列最強(qiáng)，表明間縫隙連接通訊功能恢復(fù)。

第四十頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三細(xì)胞間縫隙連接通訊功能

未處理人胃癌細(xì)胞LuciferYellow×10處理組人胃癌細(xì)胞LuciferYellow×10

第四十一頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三MGC803細(xì)胞(++)p53表達(dá)DADS組(－)第四十二頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三p21WAF1表達(dá)DADS組（＋＋＋）MGC803細(xì)胞（－）第四十三頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三MGC803細(xì)胞(－)DADS組（＋）pRb表達(dá)第四十四頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三MGC803細(xì)胞（＋＋）DADS組（－）p21ras表達(dá)第四十五頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三MGC803細(xì)胞(++)DADS組(－)C-Myc表達(dá)第四十六頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三裸鼠移植瘤形成實(shí)驗(yàn)第四十七頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三移植瘤形成實(shí)驗(yàn)第四十八頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三表1.DADS處理后各組裸鼠移植瘤重量變化情況GroupDose(mg/kg)TumorweightInhibitionrate(%)NS-1.15±0.23-SB660.44±0.1461.7aDADS500.83±0.1627.8aDADS1000.39±0.1166.1bDADS2000.31±0.0873.0b第四十九頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三移植瘤光學(xué)顯微鏡下形態(tài)變化HE×40(A:未處理組；B:100mg·kg-1DADS處理組)

第五十頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三PCNAβ-actin

各處理因素：NSSBDADSDADSDADS濃度(mg·kg-1)：—6650100200DADS處理移植瘤后PCNA蛋白表達(dá)

第五十一頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三SSH技術(shù)成功構(gòu)建DADS誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞MGC803細(xì)胞差異表達(dá)基因的cDNA文庫(kù)。差異表達(dá)片段DADS1，長(zhǎng)208bp，為人類α-synuclein基因部分序列，其上調(diào)可能與DADS誘導(dǎo)人胃癌MGC803細(xì)胞分化相關(guān)。差異表達(dá)片段DADS2，長(zhǎng)272bp，與魚(yú)類hepcidin-likeprecursormRNA具有高同源性，其上調(diào)可能與DADS造成細(xì)胞內(nèi)低鐵低氧環(huán)境，繼而誘導(dǎo)人胃癌MGC803細(xì)胞分化相關(guān)。第五十二頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

不同濃度的DADS可顯著抑制HL-60細(xì)胞的增殖，且與藥物濃度有明顯依賴關(guān)系；0.625-2.5μg/mL時(shí)，NBT還原反應(yīng)顯著增強(qiáng)，且在1.25μg·mL-1時(shí)誘導(dǎo)分化作用達(dá)峰值；DADS小鼠腎囊膜下移植的HL-60細(xì)胞具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系，21mg/kg時(shí)抑瘤率達(dá)49.5%；21～42mg/kgDADS可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向中性粒系方向分化。

DADS對(duì)HL-60細(xì)胞作用的研究第五十三頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三DADS對(duì)HL-60細(xì)胞呈濃度依賴性的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)第五十四頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三1.25μg·mL-1DADS處理HL-60細(xì)胞不同時(shí)期NBT還原反應(yīng)的變化第五十五頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

未處理的HL-60細(xì)胞處理的HL-60細(xì)胞

第五十六頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三DADS對(duì)小鼠腎囊膜下HL-60細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用第五十七頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三4.影響細(xì)胞周期蛋白活性

研究者們認(rèn)為，細(xì)胞周期的失調(diào)控是癌癥發(fā)生發(fā)展的原因，而細(xì)胞周期素cyclins、細(xì)胞周期素依賴性激酶CDKs及調(diào)節(jié)CDKs的激酶和磷酸酶則是細(xì)胞周期調(diào)控的分子基礎(chǔ)。在真核生物細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂時(shí)，其細(xì)胞周期可分為間期（G1期、S期、G2期）和M期，G1期細(xì)胞可進(jìn)入持續(xù)時(shí)間不等的G0期。第五十八頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

我們上述研究結(jié)果顯示，pRb、p21表達(dá)的增強(qiáng)和c-Myc、Ras及突變型p53表達(dá)減弱均可導(dǎo)致細(xì)胞停滯于G1期。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了MGC803細(xì)胞在DADS作用后細(xì)胞周期的分布，結(jié)果表明細(xì)胞停滯于G2期而非G1期。DADS可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞表面分化抗原CD11b表達(dá)升高，CD33表達(dá)下降及細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。第五十九頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三DADS對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞周期的影響第六十頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

0μg·mL-1DADS0.625μg·mL-1DADS

1.25μg·mL-1DADS2.5μg·mL-1DADS

5μg·mL-1DADSATRA

DADS對(duì)白血病HL-60細(xì)胞周期的影響第六十一頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三DADS對(duì)HL-60細(xì)胞周期的DNA含量的影響

第六十二頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三CD11bCD33DADS對(duì)HL-60細(xì)胞表面分化抗原的影響

第六十三頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)SB和100mg/kg、200mg/kgDADS作用后，MGC803細(xì)胞移植瘤細(xì)胞G2/M期百分率分別比NS對(duì)照組增加1.92、2.22和3.37倍(P＜0.05)，表明DADS呈濃度依賴性對(duì)移植瘤細(xì)胞有G2/M期阻滯。第六十四頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三不同濃度DADS處理后移植瘤細(xì)胞周期的變化NS組SB組

DADS50mg·kg-1組DADS100mg·kg-1組DADS200mg·kg-1組第六十五頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三研究表明，cyclin有7種，它們的表達(dá)隨細(xì)胞周期時(shí)相的轉(zhuǎn)換而發(fā)生改變，不同cyclin須與相應(yīng)的CDK結(jié)合才能促使細(xì)胞周期的完成。細(xì)胞增殖分裂過(guò)程中，cyclins有如下變化：細(xì)胞由G0期進(jìn)入G1期時(shí)，cyclinD1-3合成均增加；G1/S期時(shí)，cyclinDs及cyclinE降解，cyclinA合成增加；S期進(jìn)入G2期時(shí)，cyclinB合成逐漸增加積累；G2/M期轉(zhuǎn)換時(shí)，cyclinA、B降解，cyclinDs、E合成增加。cyclinD1在細(xì)胞增殖過(guò)程中意義最大，是G1期細(xì)胞增殖信號(hào)的關(guān)鍵蛋白。許多作者將它視為一種癌基因，其過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，最終形成腫瘤。第六十六頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

CDKs由CDK1-7組成，其在細(xì)胞周期的特定時(shí)間與相應(yīng)的cyclin結(jié)合后，并經(jīng)磷酸化或去磷酸化后方具有生物活性，促使與細(xì)胞周期有關(guān)蛋白的基因表達(dá)，從而對(duì)DNA合成及有絲分裂進(jìn)行調(diào)控。G1/S期有不同的cyclin/CDK復(fù)合體，cyclinD/CDK4和cyclinE/CDK2激酶活性是細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換所必須的，與cyclinA、E結(jié)合的CDK2激酶活性在G1/S期轉(zhuǎn)換時(shí)升高，而在M期則降低。第六十七頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

CyclinB/cdc2復(fù)合體的活性是細(xì)胞進(jìn)入M期所必的，而G1/S期轉(zhuǎn)換，關(guān)系到細(xì)胞周期的啟動(dòng)，G2/M期轉(zhuǎn)換則是細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂增殖的前提。CDIs是CDKs的負(fù)調(diào)控因子，可使CDKs失活；cyclins是CDKs的正調(diào)控因子，使CDKs活化，二者對(duì)CDK活性的影響控制細(xì)胞周期各時(shí)相的轉(zhuǎn)換。CDIs可分為兩類，一類是P16家族，包括P16、P18、P15、P19，特異地抑制CDK4和CDK6；另一類是P21家族，它包括P21、P27、P57，對(duì)CDK具有廣譜的抑制作用。第六十八頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

Lee用flavopiridol處理NSCLC細(xì)胞株NCI-H358時(shí)，發(fā)現(xiàn)flavopiridol可使該細(xì)胞生長(zhǎng)停止和誘導(dǎo)分化，且分化的啟動(dòng)與cdk2失活相一致，westernblot分析處理后細(xì)胞的有cyclinE和D1的缺失，表明CDKs調(diào)控亞單位缺失是CDK2激酶失活的一個(gè)原因，同樣CDK1、2、5的抑制劑roscovitine也可以誘導(dǎo)NCI-H358細(xì)胞分化，因此誘導(dǎo)分化劑可能通過(guò)阻抑CDK2的活性誘導(dǎo)細(xì)胞分化。第六十九頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

我們應(yīng)用Westernblot分析發(fā)現(xiàn)，在G2/M期阻滯同時(shí)有Cdc25C蛋白表達(dá)下降，但CDK1蛋白表達(dá)不受DADS作用的影響。表明DADS對(duì)MGC803細(xì)胞的抑制增殖作用與G2/M期阻滯有關(guān)，其分子機(jī)理可能與降低Cdc25C蛋白水平有關(guān)。p38通路調(diào)節(jié)Cdc25C磷酸酶的表達(dá)在DADS誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞G2/M期阻滯中起著重要作用。

第七十頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三DADS對(duì)人胃癌MGC803和BGC823細(xì)胞G2/M期檢查點(diǎn)激酶通路的影響RT-PCR檢測(cè)Chk1和Chk2在mRNA水平的改變Westernblot檢測(cè)各蛋白的改變免疫共沉淀檢測(cè)Chk1、Chk2與Cdc25C結(jié)合第七十一頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三M123456

600bp300bpChk1β-actinRT-PCR檢測(cè)MGC803、BGC823細(xì)胞Chk1mRNA表達(dá)水平

M：Marker；1：MGC803細(xì)胞對(duì)照組；2-3：DADS處理MGC803細(xì)胞1d、2d；4:BGC823細(xì)胞對(duì)照組；5-6：DADS處理BGC823細(xì)胞1d、2d第七十二頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三M123456600bp300bpChk2β-actinRT-PCR檢測(cè)MGC803、BGC823細(xì)胞Chk2mRNA表達(dá)水平M：Marker；1：MGC803細(xì)胞對(duì)照組；2－3：DADS處理MGC803細(xì)胞1d、2d；4:BGC823細(xì)胞；5－6：DADS處理BGC823細(xì)胞1d、2d

第七十三頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三DADS誘導(dǎo)MGC803和BGC823細(xì)胞Chk1和P-Chk1表達(dá)

0124812(hr)P-Chk1(Ser345)Chk1β-actin

DADS對(duì)MGC803細(xì)胞磷酸化Chk1表達(dá)的影響第七十四頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三P-Chk1(Ser345)Chk1β-actin

DADS對(duì)BGC823細(xì)胞磷酸化Chk1表達(dá)的影響

0124812(hr)

第七十五頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三DADS誘導(dǎo)MGC803和BGC823細(xì)胞Chk2和P-Chk2表達(dá)

0124812(hr)

P-Chk2Chk2β-actinDADS對(duì)MGC803細(xì)胞磷酸化Chk2表達(dá)的影響第七十六頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三0124812(hr)P-Chk2

Chk2β-actin

DADS對(duì)BGC823細(xì)胞磷酸化Chk2表達(dá)的影響第七十七頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三DADS誘導(dǎo)MGC803和BGC823細(xì)胞ATR和P-ATR的表達(dá)

015306090120(min)P-ATR（Ser428）

ATR

β-actin

DADS對(duì)MGC803細(xì)胞磷酸化ATR表達(dá)的影響第七十八頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三015306090120(min)

P-ATR（Ser428）

ATR

β-actin圖27DADS對(duì)BGC823細(xì)胞磷酸化ATR表達(dá)的影響第七十九頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三DADS誘導(dǎo)BGC823細(xì)胞Chk下游分子CDC25C、CyclinB1的表達(dá)

012243648(hr)CDC25Cβ-actinDADS對(duì)BGC823細(xì)胞Cdc25C磷酸酶表達(dá)的影響第八十頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

012243648(hr)CyclinB1

β－actin圖25DADS對(duì)BGC803細(xì)胞CyclinB1表達(dá)的影響第八十一頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三免疫共沉淀檢測(cè)Chk1激酶活性

Chk1Cdc25C

MGC803細(xì)胞BGC823細(xì)胞UntreatedTreatedbyDADSNegativecontrolUntreatedTreatedbyDADSNegativecontrol圖29免疫共沉淀Western-blot分析

MGC803和BGC823細(xì)胞中的Chk1表達(dá)第八十二頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三免疫共沉淀檢測(cè)Chk2激酶活性

Chk2

Cdc25CNegativecontrolUntreatedTreatedbyDADSNegativecontrolUntreatedTreatedbyDADSMGC803細(xì)胞BGC823細(xì)胞免疫共沉淀Western-blot分析

MGC803和BGC823細(xì)胞中Chk2的表達(dá)第八十三頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三Chk1和Chk2基因沉默對(duì)DADSG2/M期阻滯作用及檢查點(diǎn)激酶通路的影響1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RNAi后Chk1和Chk2mRNA表達(dá)的改變2.Chk1和Chk2RNAi后Chk1和Chk2蛋白表達(dá)的改變3.Chk1、Chk2基因沉默后MTT比色實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.干擾后細(xì)胞周期的改變5.Chk1和Chk2RNAi后下游蛋白表達(dá)的改變第八十四頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三定量RT-PCR檢測(cè)MGC803細(xì)胞Chk1mRNA表達(dá)的改變樣品GAPDHchk1chk1/GAPDHMGC8031.03E-015.93E-03

5.76E-02MGC803+vector2.02E-019.34E-03

4.62E-02MGC803+DADS2.93E-014.05E-03

1.38E-02MGC803+DADS+vector2.98E-014.07E-03

1.37E-02第八十五頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三定量RT-PCR檢測(cè)BGC823細(xì)胞Chk1mRNA表達(dá)的改變

樣品GAPDHchk1chk1/GAPDHBGC8231.21E-017.59E-03

6.27E-02BGC823+vector1.07E-016.41E-03

5.99E-02BGC823+DADS3.96E-013.79E-039.57E-03BGC823+DADS+vector1.26E-011.38E-03

1.1E-02第八十六頁(yè)，共九十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三定量RT-PCR檢測(cè)MGC803細(xì)胞Chk2mRNA表達(dá)的改變樣品GAPDHchk2chk2/GAPDHMGC8039.19E-02

3.65E-043.97E-03MGC803+vector1.03E-013.47E-043.37E-03MGC803+DADS9.08E-025.74E-056.32E-04MGC803+DADS+vector3.13E