分子生物學常用技術

分子生物學常用技術

分子生物學常用技術凝膠電泳分子雜交聚合酶鏈反應(PCR)技術DNA的物理圖譜DNA序列測定基因芯片2021/5/92第一節(jié)凝膠電泳

(gelelectrophoresis)電泳概念基本原理Qμ＝

6πrη

μ:遷移率

Q:電荷量

r:粒子半徑（分子量）η:介質粘度

2021/5/93電泳的用途分離鑒定純度測定分子量凝膠電泳的種類瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳

2021/5/94一、瓊脂糖凝膠電泳

(agarosegelelectrophoresis)

分離核酸原理操作要點應用范圍2021/5/95（一）分離核酸原理

電荷效應

分子篩效應

分子構象2021/5/961.電荷效應核酸是兩性電解質

pH=3.5,正電荷pH=8.0~8.3

,負電荷，正極2021/5/972021/5/982.分子篩效應小分子移動快，大分子移動慢2021/5/993.分子構象閉環(huán)超螺旋>線狀DNA>開環(huán)DNA

+-2021/5/910（二）操作要點支持物凝膠濃度的選擇

DNA分子量標準電泳緩沖液樣品制備電泳條件

DNA電泳染色

DNA片段的回收2021/5/9111.支持物2021/5/912商品化的瓊脂糖2021/5/913瓊脂糖種類普通低熔點高純高篩分熔點80~90℃<70℃80~90℃80~90℃機械強度中差高高分辨率中差中高2021/5/9142.凝膠濃度的選擇2021/5/915凝膠的制備2021/5/9162021/5/9172021/5/9183.DNAmarker2021/5/919DNAmarker2021/5/920DNA長度標準曲線2021/5/9214.電泳緩沖液

Tris-乙酸(TAE)pH8.0

Tris-硼酸(TBE)

pH8.0

Tris-磷酸(TPE)pH8.0

2021/5/9225.樣品制備上樣緩沖液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚藍/二甲苯青

2021/5/923點樣2021/5/9246.電泳條件潛水電泳恒壓電泳

低壓:1~2V/cm

中壓:8~10V/cm

高壓電泳：>幾十V/cm溫度：15~25℃

2021/5/925潛水電泳2021/5/9267.電泳染色溴乙錠(ethidiumbromide,EB)

結構及染色原理染色方法加入凝膠液中

電泳結束后染色2021/5/927EB染色原理2021/5/9282021/5/929紫外燈下顯色2021/5/9308.DNA片段的回收低熔點瓊脂糖法

透析袋電洗脫法(>5kb)DEAE-纖維素膜法(0.5~5kb)2021/5/931（三）應用范圍

DNA的分離、純化和鑒定限制性酶切圖譜分析重組體的分離、鑒定雜交分析

PCR產物的分離鑒定2021/5/932瓊脂糖凝膠電泳2021/5/933二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)

分離原理操作要點優(yōu)點應用范圍2021/5/934（一）分離原理

電荷效應分子篩效應2021/5/935PAGE支持物單體－丙烯酰胺(Acr)

交聯(lián)劑－甲叉雙丙烯酰胺(Bis)

催化劑－過硫酸胺(AP)

加速劑－N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)2021/5/936聚丙烯酰胺凝膠2021/5/937（二）操作要點凝膠的分類凝膠濃度的選擇凝膠液的配制凝膠中DNA的檢測DNA片段的回收2021/5/9381.凝膠的分類非變性凝膠：dsDNA變性凝膠:ssDNA尿素甲酰胺SDS2021/5/9392.凝膠濃度的選擇2021/5/9402021/5/9413.凝膠液的配制

試劑(ml)制備濃度(%)3.55.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml2021/5/942PAGE裝置2021/5/9432021/5/9442021/5/9452021/5/946電泳2021/5/9474.凝膠中DNA的檢測溴乙錠染色法

銀鹽染色法甲醛還原放射自顯影法Ag+－DNA

Ag（黑褐色）

2021/5/9485.DNA片段的回收壓碎浸泡法<1kb

純度高，回收率低2021/5/949（三）PAGE優(yōu)點機械強度好、化學穩(wěn)定性高分辨率高載樣量大回收的DNA純度高

2021/5/950（四）PAGE應用范圍分離、純化和鑒定RNA和小分子DNA

DNA序列分析

PCR產物鑒定蛋白質的檢測和分析2021/5/951第二節(jié)分子雜交

分子雜交的基本原理固相支持物探針幾種常用雜交技術2021/5/952一、分子雜交的基本原理

核酸的變性和復性2021/5/953分子雜交DNA-DNA2021/5/954DNA-RNA2021/5/955雜交條件

靶分子探針雜交袋雜交爐2021/5/956雜交種類被檢核酸種類和方法原位雜交斑點雜交Southern雜交Northern雜交Western雜交反應介質液相雜交固相雜交()2021/5/957二、固相支持物固相支持物的特性結合能力強不影響雜交反應結合牢固非特異性吸附少機械性能良好

2021/5/958固相支持物的種類硝酸纖維素濾膜(nitrocellulosefiltermembrane)

尼龍膜(nylonmembrane)2021/5/9591.硝酸纖維素濾膜

特點吸附ssDNA和RNA

雜交信號本底低不足不適于重復雜交濾膜較脆不適于電轉移印跡法對DNA小片段(<200bp)結合能力弱2021/5/9602.尼龍膜特點結合能力強

可反復雜交

韌性強

適于電轉移印跡法對DNA小片段(10bp)結合能力強不足雜交信號本底較高

2021/5/961分子生物學考試時間：2005.1.11(晚7:00-9:00)地點9教講演廳(150人)9-2-1(50人)9-2-2(50人)9-3-1(50人)答疑：1.10(9:00-11:30;3:00-5:30)地點：逸夫樓3樓生化實驗室2021/5/962三、探針(probe)探針的概念探針的類型

標記物的種類標記方法2021/5/9631.探針的概念特異結合和檢測靶分子的活性物質抗原－抗體配體－受體同源DNA/RNA2021/5/9642.探針的類型基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針蛋白質或多肽探針2021/5/9653.標記物的種類放射性同位素(32P,3H,35S,125I,14C)

非放射性標記物生物素地高辛熒光素酶

2021/5/9664.核酸探針的放射性標記方法

DNA缺口平移標記法隨機引物標記法

DNA的5’末端標記

2021/5/967缺口翻譯特點均一標記制備dsDNA探針2021/5/968隨機引物標記法(randompriming)

隨機引物6nt含有各種可能的排列順序特點放射比活性>缺口翻譯操作簡便DNA/cDNA探針2021/5/9692021/5/970DNA的5’末端標記(5’endlabeling)

堿性磷酸酶＋T4多核苷酸激酶標記原理制備寡核苷酸探針制備短的DNA/RNA探針

2021/5/971DNA的5’末端標記2021/5/972四、Southern雜交Southernblotting/DNAblotting1975年，EdwenSouthern等印跡(blotting):轉移

blot:aspotormark,esp.ofink

blotting

2021/5/9731.印跡的方法

毛細管轉移法

電轉移法

真空轉移法

2021/5/974毛細管轉移法2021/5/975電轉移法2021/5/976真空轉移法2021/5/9772021/5/9782.Southern雜交的步驟2021/5/9793.Southern雜交的應用基因的定性及定量分析基因的酶切圖譜分析基因突變分析RFLP2021/5/980五、Northern雜交

RNAblotting

步驟

總RNA/mRNA→變性電泳分離→轉移→雜交→放射自顯影/化學顯色

應用檢測組織/細胞中mRNA的大小、量比較不同組織/細胞中基因的表達情況

2021/5/981Northern雜交2021/5/982六、Western雜交免疫印跡(immunoblotting)

SDS→轉移→蛋白－第一抗體→標記的第二抗體(探針)→檢測

應用蛋白質的定性定量分析2021/5/9832021/5/984免疫印跡2021/5/985

Southern,Northern&Western

待測物質

支持物

探針

轉移方式Southern

DNANC單鏈核酸

毛細管/電/真空

Northern

RNANC/尼龍單鏈核酸

毛細管/電/真空

Western

蛋白質NC/PVDF

抗體電轉移

2021/5/986七、原位雜交

(insituhybridization)定義種類細胞內原位雜交組織切片原位雜交

基本程序細胞/組織固定預雜交雜交沖洗雜交信號檢測分析結果

2021/5/987組織切片2021/5/9882021/5/989八、斑點雜交

(dothybridization)

2021/5/990第三節(jié)PCR技術聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)PCR的發(fā)展簡史PCR的基本原理和步驟PCR的影響因素PCR的種類PCR的應用2021/5/991一、PCR的發(fā)展簡史1971年,Korana提出核酸體外擴增的設想1985年,Mullis等發(fā)明了PCR技術1988年,PE-Cetus公司推出了第一臺PCR儀

2021/5/992二、PCR的基本原理和步驟基本原理－DNA復制三個步驟變性(denaturation)

退火(annealing)

延伸(extension)

2021/5/993PCR的原理2021/5/994PCR的擴增產物cycle12345n長片段

246810短片段

002822長＋短

21222324252n2021/5/995標準的PCR反應體系10X擴增緩沖液：10ul模板DNA:0.1~2ug

引物：各0.2~1umol/L4種dNTP:各200umol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5U總體積：100ul2021/5/9962021/5/997三、PCR的影響因素

模板引物

TaqDNA聚合酶

4種dNTP

Mg2+循環(huán)條件

2021/5/998模板

DNARNAcDNA對模板的純度要求低2021/5/999引物長度：15～30nt

G+C含量：40~60%

堿基的隨機分布避免引物自身和引物之間的互補引物的3’端引物的5’端引物濃度：0.2~1umol/L

2021/5/9100TaqDNA聚合酶

2.5U/100ul

－20℃保存最后加

2021/5/9101底物4種dNTP

的濃度相等終濃度：200umol/L

2021/5/9102Mg2+

濃度:1.5～2.0mmol/L

過高:非特異擴增

過低:反應產物減少2021/5/9103循環(huán)條件變性溫度和時間:90~96℃,30~60s退火溫度和時間:40~60℃,30~60sTm=4(G+C)+2(A+T)

延伸溫度和時間70～75℃(72℃)<1kb,1min;3～4kb,3～4min;10kb,15min循環(huán)次數:25～35

2021/5/9104四、PCR的種類反轉錄PCR原位PCR(insituPCR)實時PCR(realtimePCR)重組PCR(recombinantPCR)錨定PCR(anchoredPCR)反向PCR(inversePCR)2021/5/9105原位PCR原位雜交＋PCR程序固定細胞/組織樣品→PCR前處理→PCR擴增→原位雜交及檢測

2021/5/9106實時PCR的原理2021/5/9107五、PCR的應用分子生物學研究臨床醫(yī)學2021/5/9108分子生物學研究基因克隆

DNA序列測定基因的體外定點突變

突變分析(PCR-SSCP)

基因定量

2021/5/9109臨床醫(yī)學病原體診斷

遺傳病的基因診斷

腫瘤檢測

法醫(yī)學

2021/5/9110第四節(jié)DNA序列測定

Sanger雙脫氧鏈終止法(1977)

Maxam-Gilbert化學裂解法(1977)2021/5/9111Sanger雙脫氧鏈終止法原理－DNA復制

反應條件模板引物

dNTP（其中一種帶放射性標記）

ddNTP

DNA聚合酶2021/5/9112DNA的復制2021/5/91132’,3’-雙脫氧核苷酸(ddNTP