生物發(fā)光原理及應(yīng)用

生物發(fā)光原理及應(yīng)用第一頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO

生物發(fā)光，即用熒光素酶基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為

。觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過(guò)程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程。相比于傳統(tǒng)（通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)宰殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而獲得數(shù)據(jù)）的方法，對(duì)一組實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細(xì)胞及基因）的移動(dòng)及變化，更可靠。

第二頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO一，技術(shù)原理二，技術(shù)應(yīng)用三，技術(shù)優(yōu)勢(shì)第三頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO一、技術(shù)原理（1）標(biāo)記原理（2）光學(xué)原理（3）實(shí)驗(yàn)過(guò)程

第四頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三哺乳動(dòng)物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素（luciferin），即可在幾分鐘內(nèi)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。（1）標(biāo)記原理

第五頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO通過(guò)分子生物學(xué)克隆技術(shù)，將熒光素酶的基因插到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，通過(guò)單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株，將標(biāo)記好的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)。觀測(cè)前需要注射熒光素酶的底物—熒光素。熒光素脂溶性非常好，很容易透過(guò)血腦屏障?！黾s一分鐘后表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞開始發(fā)光；■十分鐘后強(qiáng)度達(dá)到最高；在最高點(diǎn)持續(xù)約20～30分鐘后開始衰落，約三小時(shí)后發(fā)光全部消失?！鲎詈玫臋z測(cè)時(shí)間是在注射后15到25分鐘之間。第六頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO每次熒光素酶催化反應(yīng)只產(chǎn)生一個(gè)光子：IVIS

（infraredvideodataimagingsystem紅外視頻數(shù)據(jù)成像系統(tǒng)成像系統(tǒng)）★一個(gè)高度靈敏的制冷CCD相機(jī)

——將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)；★特別設(shè)計(jì)的成像暗箱和成像軟件可——屏蔽宇宙射線在內(nèi)的所有射線

——觀測(cè)、記錄并分析這些信號(hào)第七頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，在偏紅光區(qū)域，大量的光可以穿過(guò)組織和皮膚而被檢測(cè)到（衍射）。在相同的深度情況下，檢測(cè)到的發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系。軟件為每一次使用提供一張圖片作為數(shù)據(jù)結(jié)果，記錄了發(fā)射出的光子數(shù)據(jù)。顏色體現(xiàn)了單位面積中發(fā)射光子的數(shù)量，信號(hào)強(qiáng)度高的為紅色，低的為紫色。（2）光學(xué)原理

第八頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO◆麻醉系統(tǒng)麻醉小鼠后放入成像暗箱平臺(tái)◆軟件控制平臺(tái)的升降到一個(gè)合適的視野，自動(dòng)開啟照明燈拍攝第一次背景圖?！糇詣?dòng)關(guān)閉照明燈，在沒(méi)有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像?！襞c第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動(dòng)物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。

（3）實(shí)驗(yàn)步驟

第九頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO軟件完成圖像分析過(guò)程：使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進(jìn)行測(cè)量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當(dāng)選定需要測(cè)量的區(qū)域后，軟件可以計(jì)算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

第十頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO二、技術(shù)應(yīng)用（1）標(biāo)記細(xì)胞（2）標(biāo)記病毒（3）標(biāo)記細(xì)菌（4）基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的相互作用（5）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

第十一頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO（1）標(biāo)記細(xì)胞◆癌癥與抗癌藥物研究直接快速地測(cè)量各種癌癥模型中腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并可對(duì)癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估?；铙w生物發(fā)光成像能夠無(wú)創(chuàng)傷地定量檢測(cè)小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。通過(guò)給予腫瘤接種的小鼠不同的劑量，并不同的給藥時(shí)間、不同的給藥途徑，觀察抗腫瘤藥物的最佳給藥途徑、給藥劑量并給藥時(shí)間，從而制定合適的劑型與服藥時(shí)間。第十二頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO（1）標(biāo)記細(xì)胞◆癌癥與抗癌藥物研究

●U251-HRE細(xì)胞：其中的熒光素酶基因表達(dá)受可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的操控，低氧狀態(tài)為其誘導(dǎo)條件。當(dāng)腫瘤發(fā)展到300~500mg時(shí)，局部組織低氧（微環(huán)境），表達(dá)；●組織切片也可以觀察到生物發(fā)光，熒光素酶的體外活性保持時(shí)間比較短，約幾十分鐘；●已商品化的腫瘤細(xì)胞株包括：前列腺癌，乳腺癌，子宮頸癌和結(jié)腸癌等細(xì)胞系模型。第十三頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO（1）標(biāo)記細(xì)胞◆免疫學(xué)與干細(xì)胞研究將熒光素酶標(biāo)記的造血干細(xì)胞移植入脾及骨髓，可用于實(shí)時(shí)觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)干細(xì)胞造血過(guò)程的早期事件及動(dòng)力學(xué)變化。有研究表明，應(yīng)用帶有生物發(fā)光標(biāo)記基因的小鼠淋巴細(xì)胞，檢測(cè)放療及化療效果。

●可觀察流體細(xì)胞在體內(nèi)的動(dòng)向和變化；●能更快捷地得到免疫系統(tǒng)中病原的轉(zhuǎn)移途徑。第十四頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO（1）標(biāo)記細(xì)胞◆細(xì)胞凋亡當(dāng)熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白無(wú)熒光素酶活性，細(xì)胞不能發(fā)光；而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，活化的caspase-3（細(xì)胞凋亡蛋白酶）在特異識(shí)別位點(diǎn)切割去掉抑制蛋白，恢復(fù)熒光素酶活性，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象?！駲z測(cè)正在凋亡的細(xì)胞狀況。

第十五頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO（2）標(biāo)記病毒◆病毒侵襲以熒光素酶基因標(biāo)記的HSV-1（1-型單純皰疹病毒herpessimplexvirus1）病毒為例，可觀察到HSV-1病毒對(duì)肝臟、肺、脾及淋巴結(jié)的侵襲和病毒從血液系統(tǒng)進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)的過(guò)程?！穸喾N病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，乙肝病毒等，已被熒光素酶標(biāo)記，用于觀察病毒對(duì)機(jī)體的侵染過(guò)程。第十六頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO（3）標(biāo)記細(xì)菌◆細(xì)菌侵染研究可以用標(biāo)記好的革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌侵染活體動(dòng)物，觀測(cè)其在動(dòng)物體內(nèi)的繁殖部位、數(shù)量變化及對(duì)外界因素的反應(yīng)。第十七頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO（3）標(biāo)記細(xì)菌◆抗生素藥物研究利用標(biāo)記好的細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)藥物的反應(yīng)，醫(yī)藥公司和研究機(jī)構(gòu)可用這種成像技術(shù)進(jìn)行藥物篩選和臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。●近年來(lái)，國(guó)際上大型制藥公司紛紛將精諾真技術(shù)在動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為FDA（美國(guó)食品和藥品檢驗(yàn)局）藥物申報(bào)材料中非常重要的臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分。第十八頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO（4）基因表達(dá)和蛋白質(zhì)相互作用

◆組織特異性基因表達(dá)一種細(xì)胞可被兩種熒光素酶標(biāo)記：renilla熒光素酶基因由一組成性穩(wěn)定表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，作為內(nèi)參，反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的變化；firefly熒光素酶基因由要研究的組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。●這樣firefly熒光素酶發(fā)光信號(hào)的變化，在消除細(xì)胞數(shù)量變化的影響后就可反應(yīng)特定的啟動(dòng)子在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)活性。第十九頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO（4）基因表達(dá)和蛋白質(zhì)相互作用◆基因治療基因治療包括在體內(nèi)將一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因及其產(chǎn)物安全而有效地傳遞到靶細(xì)胞。●應(yīng)用熒光素酶基因作為報(bào)告基因用于載體的構(gòu)建，觀察目的基因是否能夠在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)高效和組織特異性表達(dá)；●插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中，用來(lái)觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運(yùn)輸和基因治療情況:容易準(zhǔn)備、低毒性及輕微免疫反應(yīng)。第二十頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO（4）基因表達(dá)和蛋白質(zhì)相互作用◆蛋白質(zhì)相互作用將熒光素酶基因分成兩段，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA，然后導(dǎo)入細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)為融合蛋白。當(dāng)兩種蛋白有強(qiáng)相互作用時(shí)，表達(dá)的熒光素酶兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶，在有底物存在時(shí)出現(xiàn)生物發(fā)光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。

●此原理亦可用于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑。第二十一頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO（5）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型◆基因表達(dá)將熒光素酶基因插入目的基因啟動(dòng)子的下游，并穩(wěn)定整合于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。利用其表達(dá)產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應(yīng)目的基因的表達(dá)情況（何時(shí)、何種刺激下表達(dá)），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的研究。●動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中特定基因的時(shí)空表達(dá)情況；●觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達(dá)；●其它生物學(xué)事件引起的相應(yīng)基因表達(dá)或關(guān)閉。第二十二頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO（5）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型◆各種疾病模型研究者根據(jù)研究目的，將靶基因、靶細(xì)胞、病毒及細(xì)菌進(jìn)行熒光素酶標(biāo)記，同時(shí)轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等等?！裉峁┌谢蛟隗w內(nèi)的實(shí)時(shí)表達(dá)和對(duì)候選藥物的準(zhǔn)確反應(yīng)；●評(píng)估候選藥物和其它化合物的毒性；●為藥物在疾病中的作用機(jī)制及效用提供研究方法。第二十三頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO三、技術(shù)優(yōu)勢(shì)

腫瘤轉(zhuǎn)移研究，基因治療，流行病學(xué)的發(fā)病學(xué)研究，干細(xì)胞示蹤，白血病的相關(guān)研究等是該技術(shù)非常有優(yōu)勢(shì)的領(lǐng)域。在藥物開發(fā)方面，用該技術(shù)進(jìn)行腫瘤的藥效研究，比傳統(tǒng)方法更靈敏，還可以通過(guò)一系列轉(zhuǎn)基因疾病動(dòng)物模型，來(lái)快速直觀的進(jìn)行相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理和藥物篩選研究。第二十四頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO三、技術(shù)優(yōu)勢(shì)

（1）無(wú)創(chuàng)傷性，可快速掃描，一天可檢測(cè)幾百只；（2）有更高的靈敏度，可以在感染早期就進(jìn)行活體觀察；（3）可以有結(jié)構(gòu)信息，在活體動(dòng)物整體上觀察感染途徑；（4）對(duì)同一批老鼠自身對(duì)照，有效持續(xù)觀察，減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，避免個(gè)體間差異；（5）定量結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以靶細(xì)胞單位時(shí)間內(nèi)發(fā)射光子數(shù)的絕對(duì)量表示，它與標(biāo)記的靶細(xì)胞數(shù)量或基因表達(dá)情況直接線性相關(guān)。第二十五頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO熒光素酶的穩(wěn)定性◆熒光素酶基因是插到細(xì)胞染色體內(nèi)的，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí)，熒光酶也會(huì)得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。◆標(biāo)記的腫瘤接種以后，從理論上講，會(huì)發(fā)生luciferase的丟失，但是還沒(méi)有正式的報(bào)道。丟失的量，非常小，可以忽略不記，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第二十六頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO儀器靈敏度◆穿透性可達(dá)到3～4cm。在標(biāo)記細(xì)胞活躍發(fā)光的情況下，儀器可以檢測(cè)到最少100個(gè)皮下接種的發(fā)光細(xì)胞；◆若細(xì)胞在體內(nèi)位置深（如原位種植），比如內(nèi)臟，最少能檢測(cè)到的細(xì)胞數(shù)目需要多一些。一般每增加0.5cm可檢測(cè)到的最少細(xì)胞數(shù)增加一個(gè)數(shù)量級(jí)。第二十七頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期三LOGO國(guó)內(nèi)首臺(tái)