生物制藥工藝學(xué)-課件

第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

Basisofbiopharmaceuticaltechnology

1醫(yī)學(xué)資源

一、生物材料的選擇：

1．生物活性物質(zhì)存在部位：胞內(nèi)、胞外、胞漿、質(zhì)膜、器膜、周質(zhì)

2．生物材料的采集與質(zhì)控

（1）品種鑒定；（2）防止污染與感染；（3）選擇富集目的物材料；（4）冷凍保存

第一節(jié)生物藥物提取、分離、純化技術(shù)基礎(chǔ)2醫(yī)學(xué)資源

二、生物活性物質(zhì)物質(zhì)常用的提取方法與優(yōu)化

（一）幾種常用提取方法

1．酸、堿、鹽水溶液提取方法

2．表面活性劑提取方法與反膠束提取方法

3．有機(jī)溶劑提取

4.雙水相萃取法

5．超臨界萃取法

3醫(yī)學(xué)資源（二）提取方法與優(yōu)化

1.溶劑選擇

2.選擇添加劑①保護(hù)劑；②酶抑制劑

3.提取條件①溫度；②pH；③鹽；④表面活性劑4醫(yī)學(xué)資源三．濃縮與干燥1.濃縮方法：①鹽析；②有機(jī)溶劑沉淀；③高分子脫水④超濾；⑤真空濃縮或薄膜濃縮；

（書(shū)P45頁(yè)）5醫(yī)學(xué)資源6醫(yī)學(xué)資源2.干燥：①低溫真空干燥；②噴霧干燥；③冷凍干燥

（書(shū)P47頁(yè)）7醫(yī)學(xué)資源8醫(yī)學(xué)資源9醫(yī)學(xué)資源四、分離純化1.生化制藥工藝中分離純化特點(diǎn):(1)生物材料組成復(fù)雜

(2)目的物含量低

(3)易變性、失活

(4)分離方法有很大經(jīng)驗(yàn)成分

(5)步驟多，逐級(jí)分離

(6)產(chǎn)品驗(yàn)證與化學(xué)上純度概念不完全相同(書(shū)P49頁(yè))10醫(yī)學(xué)資源2.分離純化原理

P49頁(yè)

(1)根據(jù)分子形狀與分子大小

(2)根據(jù)電荷差異

(3)根據(jù)分子極性與溶解度大小

(4)根據(jù)吸附特性

(5)根據(jù)生物配基特性11醫(yī)學(xué)資源3.選擇原則（1）粗品分離：大處理量,相對(duì)低分辨率鹽析，分級(jí)沉淀，萃取，超濾（2）精制：高分辨率多種色譜層析法,親和層析，HPLC，F(xiàn)PLC，電泳或等電聚焦12醫(yī)學(xué)資源

第二節(jié)微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

一、菌種的選育與保藏1．自然選育依據(jù)自發(fā)突變?cè)恚ㄟ^(guò)不斷分離篩選，除去衰變菌落，選擇高產(chǎn)菌，達(dá)到強(qiáng)化、復(fù)壯、穩(wěn)定生產(chǎn)目的。方法：（1）平板劃線(xiàn)法（2）稀釋平板法13醫(yī)學(xué)資源2．誘變育種（1）出發(fā)菌株的選擇①:穩(wěn)定性;②:具備某種優(yōu)良性狀的菌株③:對(duì)誘變劑敏感;④:生理狀態(tài)及生長(zhǎng)時(shí)間（2）誘變處理:①化學(xué)誘變；②物理誘變;③生物誘變（3）篩選：①隨機(jī)篩選；②半理性化篩選14醫(yī)學(xué)資源突變株篩選一般進(jìn)程如圖所示

第三第四輪同第二輪第三第四輪同第二輪15醫(yī)學(xué)資源3、現(xiàn)代菌種選育技術(shù)①：雜交育種②：原生質(zhì)體融合③：基因工程技術(shù)

(P55頁(yè))16醫(yī)學(xué)資源3．菌種保存（1）保存目的：防止退化（2）菌種退化檢查方法（3）菌種退化防止方法①防止基因突變：如低溫保藏②采用雙重缺陷型③制作平行的菌種斜面，少傳代④分離單菌落，自然篩選⑤選擇培養(yǎng)條件17醫(yī)學(xué)資源（4）菌種保藏方法：①斜面低溫保存②液體石蠟封藏法③甘油冷凍法④冷凍干燥法⑤液氮保藏法18醫(yī)學(xué)資源二、發(fā)酵工程技術(shù)基礎(chǔ)

發(fā)酵工程：?jiǎn)渭?xì)胞純培養(yǎng)工業(yè)化過(guò)程，以產(chǎn)生大量目的物。

1．液體培養(yǎng)——深層發(fā)酵

2．固體培養(yǎng)——淺盤(pán)培養(yǎng)發(fā)酵設(shè)備：空壓機(jī)、種子罐、發(fā)酵罐，蒸汽發(fā)生器、空氣過(guò)濾器、離心機(jī)及多種參數(shù)控制與檢測(cè)設(shè)備，以L(fǎng)-Lys生產(chǎn)設(shè)備為例，見(jiàn)圖1所示。

19醫(yī)學(xué)資源圖1L-Lys生產(chǎn)過(guò)程工藝設(shè)備圖20醫(yī)學(xué)資源

第三節(jié)生物技術(shù)藥物制造技術(shù)基礎(chǔ)

一、重組DNA技術(shù)原理1．基因工程操作過(guò)程：

（1）獲得目的基因；（2）構(gòu)建DNA重組體；（3）將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；（4）工程菌的克隆與鑒定；（5）目的基因擴(kuò)增與蛋白表達(dá)。

21醫(yī)學(xué)資源2．基因工程藥物制造過(guò)程22醫(yī)學(xué)資源二、基因工程主要操作技術(shù)1．目的基因的獲得（1）cDNA文庫(kù)純化目的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA①mRNA的分離②cDNA第一鏈的合成③cDNA第二鏈的合成④cDNA與載體連接⑤轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化⑥篩選目的克隆23醫(yī)學(xué)資源目的基因的獲得：cDNA文庫(kù)24醫(yī)學(xué)資源（2）PCR法或逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）

典型PCR反應(yīng)包括①模板變性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（1～2′）③延伸72℃（1～2′）在高溫聚合酶作用下，以DNA單鏈為模板，由引物起始從5′→3′

延伸。25醫(yī)學(xué)資源26醫(yī)學(xué)資源（3）化學(xué)合成法

在已知DNA序列或多肽的一般結(jié)構(gòu)時(shí)，如鏈長(zhǎng)在60bp～100bp可用化學(xué)合成法直接合成DNA。27醫(yī)學(xué)資源2．DNA重組體的構(gòu)建根據(jù)宿主菌不同，選擇基因載體（Vector）（1）E.coli質(zhì)粒非表達(dá)型

pBR322，表達(dá)型pUC，實(shí)用型pBV220，PET系統(tǒng)，λ噬菌體DNA作為載體，非表達(dá)型λgt10，表達(dá)型λgt11。（2）芽孢桿菌pUB110pE194和pC194（3）鏈霉菌pIJ101pSG5

cDNA與載體連接方法①同聚尾連接法②人工接頭連接法28醫(yī)學(xué)資源3．重組體的表達(dá)系統(tǒng)（1）原核表達(dá)系統(tǒng)①E.coli；②芽孢桿菌Bacillus；③鏈霉菌Streptomyces

優(yōu)點(diǎn)：易大量生產(chǎn)，成本低，周期短缺點(diǎn)：多為胞內(nèi)表達(dá)、提取困難，易生成包含體、含起始密碼Met(AUG)，有內(nèi)毒素毒性29醫(yī)學(xué)資源（2）真核表達(dá)系統(tǒng)①酵母表達(dá)畢赤酵母（pichia

psatoris）受甲醇誘導(dǎo)優(yōu)點(diǎn)：易培養(yǎng)無(wú)毒性，易高密度發(fā)酵（100g/L），高表達(dá)，成本低，產(chǎn)物可糖基化，有分泌表達(dá)。②動(dòng)物細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞——CHO（倉(cāng)鼠細(xì)胞）昆蟲(chóng)細(xì)胞——家蠶細(xì)胞30醫(yī)學(xué)資源4．表達(dá)產(chǎn)物的純化包含體inclusionbodies:大部分是表達(dá)產(chǎn)物，（還有細(xì)胞蛋白和膜蛋白）一級(jí)結(jié)構(gòu)正確、無(wú)活性，不溶于水，可用變?nèi)軇㏒DS尿素，鹽酸胍溶解，再稀釋透析除去變性劑，使其復(fù)性。31醫(yī)學(xué)資源

為防止或減少包含體的形成常用方法：

（1）降低培養(yǎng)溫度從37℃降到30℃可顯著降低包含體形成率。（2）以硫氧還原蛋白為載體進(jìn)行融合表達(dá)。硫氧還原蛋白是E.coil的一種同源蛋白，定位于粘附區(qū)，富含-SH,可保目的蛋白不發(fā)生分子錯(cuò)誤折疊，是一種熱穩(wěn)定蛋白，表達(dá)產(chǎn)物聚集于粘附區(qū)，通過(guò)振擾提取使產(chǎn)物進(jìn)入介質(zhì)中，再酶解就得到目的蛋白。32醫(yī)學(xué)資源三、酶工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)1、酶工程(enzymeengineering)

研究?jī)?nèi)容（1）酶的發(fā)現(xiàn)、分離純化與生產(chǎn)應(yīng)用。（2）酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)與酶反應(yīng)器。（3）生物酶工程：以基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究酶工程。（4）抗體酶、模擬酶合成酶及酶的人工設(shè)計(jì)。（書(shū)P102）33醫(yī)學(xué)資源2、固定化酶(immobilizedenzyme)（1）固定化穩(wěn)定性提高（2）可重復(fù)使用、提高使用效率、降低成本（3）提高強(qiáng)度，便于連續(xù)、自動(dòng)、規(guī)?；a(chǎn)（4）便于產(chǎn)物的分離、純化34醫(yī)學(xué)資源共價(jià)鍵結(jié)合酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)酶的固定化技術(shù)和固定化酶35醫(yī)學(xué)資源3、制備方法：（1）吸附法：分為物理吸附法和離子交換吸附法（2）包埋法：將酶或細(xì)胞定位于凝膠高聚物網(wǎng)絡(luò)中，如卡拉膠，海藻膠，聚丙烯酰胺（3）共價(jià)鍵結(jié)合法：酶分子與載體分子，通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)使酶與載體共價(jià)結(jié)合。（4）交聯(lián)法：用雙功能試劑將酶與載體交聯(lián)固定化

圖:酶固定化方法示意1.離子結(jié)合2.共價(jià)結(jié)合3.交聯(lián)4.聚合物包埋5.疏水作用6.脂質(zhì)體包埋7.微膠囊36醫(yī)學(xué)資源第四節(jié)生物制藥工藝中試放大設(shè)計(jì)

一、中試放大目的與規(guī)模1．目的：（1）建立穩(wěn)定工藝、大批量制備足量合格產(chǎn)品，供應(yīng)臨床前與臨床研究；（2）研究工藝參數(shù)制定工藝規(guī)程和檢定規(guī)程，為正式生產(chǎn)提供工藝參數(shù)，保證能在以后生產(chǎn)中應(yīng)用。37醫(yī)學(xué)資源2．規(guī)模：中試是由小試轉(zhuǎn)入工業(yè)化生產(chǎn)的過(guò)渡性研究，是取得成功產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。38醫(yī)學(xué)資源3、中試放大時(shí)應(yīng)具備的條件（1）有穩(wěn)定的工藝：收率，質(zhì)量可靠（2）操作條件基本確立（3）已建立中間品和成品分析方法（4）生物材料已鑒定（5）物料平衡、三廢處理已基本解決（6）中試規(guī)模、產(chǎn)品產(chǎn)量，規(guī)模已確定（7）安全生產(chǎn)已有方案39醫(yī)學(xué)資源4．中試放大要解決的問(wèn)題（1）原輔材料規(guī)格（2）設(shè)備選型與材質(zhì)選用（3）反應(yīng)條件（4）原輔料中間品、產(chǎn)品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)與檢定方法（5）下游工藝優(yōu)化與穩(wěn)定制造規(guī)程的制定40醫(yī)學(xué)資源二．中試放大方法與總結(jié)內(nèi)容1、放大方法

（1）經(jīng)驗(yàn)放大（2）相似放大（3）數(shù)學(xué)模型放大2、總結(jié)內(nèi)容：（1）確定工藝路線(xiàn)，優(yōu)化工藝條件，制定制造規(guī)程。（2）制定崗位操作、投產(chǎn)（3）進(jìn)行材料衡算（4）安全生產(chǎn)與處理（5）原輔料及產(chǎn)品質(zhì)控方法與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。（6）產(chǎn)品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)制定（7）消耗定額，成本核算，工時(shí)，生產(chǎn)周期計(jì)算。

41醫(yī)學(xué)資源

第五節(jié)生物制藥工藝技術(shù)若干進(jìn)展

一、21世紀(jì)的熱門(mén)生物技術(shù)

1．組合生物合成組合生物合成(combinatorialbiosynthesis)或組合生物學(xué)(combinatorialbiology)是指應(yīng)用基因重組技術(shù)重新組合微生物藥物的基因簇,產(chǎn)生一些新的非天然的基因簇,從而合成許多新的非天然的化合物,為生物藥物的篩選提供豐富的化合物資源42醫(yī)學(xué)資源

微生物藥物通常是由非常簡(jiǎn)單的化學(xué)物質(zhì),如小分子羧酸或某些氨基酸作為合成起始單位和延伸單位合成的,參與合成的酶為一系列基因編碼的多酶體系(構(gòu)成一個(gè)合成途徑)。研究表明,參與這類(lèi)小分子生物合成的基因通常是連鎖或鄰接而構(gòu)成一個(gè)基因簇(cluster),這為基因的克隆和操作提供了方便,同時(shí)由于參與次級(jí)代謝生物合成酶系對(duì)底物的特異性,專(zhuān)一性要求不是很?chē)?yán)格的,對(duì)結(jié)構(gòu)相類(lèi)似的底物均可識(shí)別,這一特點(diǎn)為不同基因組合產(chǎn)生新的化合物創(chuàng)造了條件。43醫(yī)學(xué)資源組合生物合成技術(shù)在藥物研發(fā)中的應(yīng)用酮基合成酶(KS)、?；D(zhuǎn)移酶（AT）、脫氫酶（DH）、烯醇還原酶（ER）、酮基還原酶（KR）和酰基載體蛋白（ACP）等功能域44醫(yī)學(xué)資源45醫(yī)學(xué)資源組合生物合成技術(shù)示意圖酶1酶2酶3化合物A

B

C

D酶1基因酶2基因酶3基因基因克隆AD質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至宿主菌酶或蛋白質(zhì)46醫(yī)學(xué)資源

2．藥物基因組學(xué)是一門(mén)研究個(gè)人的基因遺傳如何影響身體對(duì)藥物的反應(yīng)的一門(mén)科學(xué)。由對(duì)基因的研究發(fā)現(xiàn)帶有某種特定基因的人，會(huì)對(duì)某種特定的藥物成份，產(chǎn)生某種特定的反應(yīng)。將這個(gè)基因、藥物成份與服用后反應(yīng)的一連串關(guān)聯(lián)，運(yùn)用在用藥之上，就可以知道帶有某特定基因之人，不適合服用含有某特定成份的藥物，進(jìn)而降低藥物副作用產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)；反之，也可以知道帶有某特定基因之人，特別適合服用含有某特定成份的藥物，進(jìn)而提升治愈疾病的機(jī)率

3．藥物蛋白質(zhì)組學(xué)47醫(yī)學(xué)資源

4．蛋白質(zhì)工程

5．基因治療與基因疫苗

6．糖基化工程

7．先導(dǎo)物高通量篩選與藥物合理設(shè)計(jì)（rationaldrugdesign）

8．核酶、抗體酶、干擾RNA9．藥物生物信息學(xué)

10．功能抗體與人工智能技術(shù)和虛擬人技術(shù)48醫(yī)學(xué)資源二、蛋白質(zhì)工程與蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)工程：

在基因水平上設(shè)計(jì)表達(dá)新的功能蛋白

1．產(chǎn)品的特點(diǎn)（1）改善穩(wěn)定性（2）提高生物活性（3）延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期（4）降低免疫原性49醫(yī)學(xué)資源2．蛋白質(zhì)工程研究基本程序