毛細(xì)管電泳的基本原理及應(yīng)用

毛細(xì)管電泳的基本原理及應(yīng)用摘要：毛細(xì)管電泳法是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。該技術(shù)可分析的成分小至有機(jī)離子、大至生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等。可用于分析多種體液樣本如血清或血漿、尿、腦脊液及唾液等，比HPLC分析高效、快速、微量。關(guān)鍵詞：毛細(xì)管電泳原理分離模式應(yīng)用1概述毛細(xì)管電泳(CaillaryElectrophoresis)簡(jiǎn)稱CE，是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離分析技術(shù)。CE的歷史可以追溯到1967年瑞典Hjerten最先提出在直徑為3mm的毛細(xì)管中做自由溶液的區(qū)帶電泳(CapillaryZoneElectro-phoresis，CZE)。但他沒(méi)有完全克服傳統(tǒng)電泳的弊端[1]?，F(xiàn)在所說(shuō)的毛細(xì)管電泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他們使用了75mm的毛細(xì)管柱，用熒光檢測(cè)器對(duì)多種組分實(shí)現(xiàn)了分離。1984年Terabe將膠束引入毛細(xì)管電泳，開(kāi)創(chuàng)了毛細(xì)管電泳的重要分支:膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MEKC)。1987年Hjerten等把傳統(tǒng)的等電聚焦過(guò)程轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行。同年，Cohen發(fā)表了毛細(xì)管凝膠電泳的工作。近年來(lái)，將液相色譜的固定相引入毛細(xì)管電泳中，又發(fā)展了電色譜，擴(kuò)大了電泳的應(yīng)用范圍。毛細(xì)管電泳和高效液相色譜（HPLC）一樣，同是液相分離技術(shù)，因此在很大程度上HPCE與HPLC可以互為補(bǔ)充，但是無(wú)論從效率、速度、樣品用量和成本來(lái)說(shuō)，毛細(xì)管電泳都顯示了一定的優(yōu)勢(shì)毛細(xì)管電泳（CE）除了比其它色譜分離分析方法具有效率更高、速度更快、樣品和試劑耗量更少、應(yīng)用面同樣廣泛等優(yōu)點(diǎn)外，其儀器結(jié)構(gòu)也比高效液相色譜（HPLC）簡(jiǎn)單。CE只需高壓直流電源、進(jìn)樣裝置、毛細(xì)管和檢測(cè)器。毛細(xì)管電泳具有分析速度快、分離效率高、試驗(yàn)成本低、消耗少、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、材料學(xué)以及與化學(xué)有關(guān)的化工、環(huán)保、食品、飲料等各個(gè)領(lǐng)域[2]。2毛細(xì)管電泳的設(shè)備和基本原理毛細(xì)管電泳法是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法[3]。毛細(xì)管電泳儀的基本組成如圖1、1所示。熔融石英毛細(xì)管的兩端分別浸在含有電解緩沖液的貯液瓶中，毛細(xì)管內(nèi)也充滿同樣的電解緩沖液。在毛細(xì)管接收端之前安裝在線檢測(cè)系統(tǒng)。被分析樣品可以從進(jìn)樣系統(tǒng)采用重力法、電遷移法、抽真空法等多種進(jìn)樣方式引入到毛細(xì)管的進(jìn)樣端。當(dāng)樣品被引入后,便開(kāi)始在毛細(xì)管兩端施加電壓。樣品溶液中溶質(zhì)的帶電組分在電場(chǎng)的作用下根據(jù)各自的荷質(zhì)比向檢測(cè)系統(tǒng)方向定向遷移。CE中的毛細(xì)管目前大多是石英材料。當(dāng)石英毛細(xì)管中充入pH值大于3的電解質(zhì)溶液時(shí),管壁的硅羥基(-SiOH)便部分解離成硅羥基負(fù)離子(-SiO-),使管壁帶負(fù)電荷。在靜電引力下,-SiO-會(huì)把電解質(zhì)溶液中的陽(yáng)離子吸引到管壁附近，并在一定距離內(nèi)形成陽(yáng)離子相對(duì)過(guò)剩的擴(kuò)散雙電層(見(jiàn)圖2[4])?？芍苯颖O(jiān)測(cè)。蛋白被酶解或化學(xué)裂解成肽片斷，利用CZE的高分辨率分離后所得的電泳圖稱CE肽圖。肽圖是進(jìn)行蛋白序列分析的第一步，隨后可用CE進(jìn)行微量制備，再測(cè)定各片斷的氨基酸序列，即可得出整個(gè)蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)。CE的制備總量比高效液相色譜低，只適用于微量制備。對(duì)擴(kuò)散系數(shù)小的生物大分子而言，CE比HPLC的分辨率高得多，因此CE被用來(lái)作為收集非常純的單一餾份的微量制備的手段。在有些情況下，CE定量線性范圍可達(dá)(3個(gè)數(shù)量級(jí))。4.4CE用于糖類的分析近年來(lái)，毛細(xì)管電泳已成為分析單糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等糖類化合物的有力武器，在糖型分析。方面也取得了較大的成功單糖的pKa6值一般大于11，故需選用強(qiáng)堿性的緩沖液（pH>11），使糖基上的羥基去質(zhì)子而帶負(fù)電荷，直接進(jìn)行電泳分離，用紫外（195nm）檢測(cè)。也可以選用硼酸鹽緩沖液，硼酸鹽與糖基絡(luò)合形成帶負(fù)電荷的絡(luò)合物以進(jìn)行電泳分離，用紫外檢測(cè)。簡(jiǎn)單單糖的分析方法也適于簡(jiǎn)單寡糖的分析[12]。多糖一般利用酸解或酶解的方法將其轉(zhuǎn)化為寡糖后進(jìn)行分析。糖蛋白經(jīng)蛋白酶酶解后生成糖肽，糖肽的圖譜被認(rèn)為是糖蛋白的指紋圖譜。糖肽的分離主要是基于其pKa值的不同而進(jìn)行CE分離，并不是基于糖鏈結(jié)構(gòu)的不同，因此所選用的緩沖液的組成及其pH的選擇尤為重要，其檢測(cè)也是基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)。糖脂既可以直接用CE分離，也可以用神經(jīng)酰胺聚糖酶將糖鏈釋放出來(lái)后進(jìn)行分析。糖胺聚糖（GAG）類糖基的聚糖部分有透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和肝素等，一般都含有重復(fù)的二糖單元，而且可用裂解酶降解成糖醛酸化酸性寡糖，這些寡糖既帶電荷又有紫外吸收（232nm），因此很適合用CE進(jìn)行分析。另外，CE在糖型分析方面也取得了較大的成功。在糖的檢測(cè)方面，紫外分析是最早用于CE進(jìn)行糖類檢測(cè)的，但它的靈敏度相對(duì)不高，檢出限一般只有10—6mol數(shù)量級(jí)。利用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)對(duì)糖類進(jìn)行柱前高效熒光標(biāo)記，可使檢出限達(dá)到10-9mol水平。在改進(jìn)檢測(cè)系統(tǒng)的同時(shí)，中性糖類的極性標(biāo)記也在不斷改進(jìn)與完善。其中一種極性標(biāo)記物為8-氨基-萘-1，3，6-三磺酸，利用其可以快速高效地對(duì)均一寡糖和復(fù)雜多糖進(jìn)行分離分析，具有很高的分辨率。4.5CE在臨床化學(xué)上的應(yīng)用CE在臨床化學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛,所檢測(cè)樣品的來(lái)源可分為尿樣、血漿血清、腦脊液、紅細(xì)胞、其它體液或組織以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體(invivo)試驗(yàn)。被分析的組分則包括肽類、各種蛋白、病毒、酶、糖類、寡核苷酸、DNA、小的生物活性分子、離子、藥物及其代謝產(chǎn)物。具體應(yīng)用可分為:臨床疾病診斷臨床蛋白分析、臨床藥物監(jiān)測(cè)、代謝研究、病理研究、同工酶分析、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物分析、DNA片斷及序列分析等。所應(yīng)用的CE模式包括CZE、MECC、CGE、CITP和毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)[13.14]。4.6CE用于檢測(cè)非均一性(多樣性,Heterogeneity)許多純化蛋白,甚至在它們的天然狀態(tài),往往都不是單一分子片斷,而是由相關(guān)分子組成,稱為非均一性(多樣性)。產(chǎn)生多樣性的原因有:氨基酸(AA)的序列不同,如突變體的某位置AA改變或AA側(cè)鏈改變;后轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的多肽鏈;糖蛋白不同程度的糖基化,如存在不同數(shù)量的寡糖鏈,寡糖鏈有不同的單糖組成、序列及單糖之間的異構(gòu)連接。采用CZE,MECC,CIEF,CE-MS可檢測(cè)這些非均一性。用于心臟病的重組人組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(rtPA)含4個(gè)可能糖基。Yim[15]用CZE和CIEF研究了制備過(guò)程中rtPA不同糖基化程度引起的非均一性,結(jié)果表明,CIEF方法要比CZE的好。還有用CZE對(duì)人促紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)[16]、用MECC對(duì)重組人C2干擾素(IFN2C)[17]及CE-MS[18]研究蛋白的多樣性。有關(guān)蛋白的非均一性在臨床中的一些應(yīng)用,如人鐵傳遞蛋白、血清蛋白的變異、異構(gòu)酶的分析等。4.7CE用于農(nóng)藥殘留量的分析對(duì)農(nóng)藥殘留物的測(cè)定國(guó)外研究的較多。Lazer等[19]將飛行時(shí)間質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳儀聯(lián)用，采用樣品堆積技術(shù)進(jìn)樣對(duì)Paraquat和Diquat兩種除草劑進(jìn)行了分離，檢測(cè)限低至10-17mol/L。Farran等[20]采用φ(乙腈)=50%的磷酸-硼砂緩沖液分離出兩種苯氧羧酸類除草劑。Hinsmann等[21]通過(guò)自動(dòng)在線濃縮樣品，采用固相微柱以十二烷基硫酸鈉(SDS)作膠束,添加少量乙腈,在13min內(nèi)分離測(cè)定了水中的7種不同種類的農(nóng)藥?；酋ｋ孱惢衔锸且活愊鄬?duì)較新的除草劑，因此這一類化合物在水和食品中的殘留量的測(cè)定十分重要。LipezAvila等[22]采用3μmODS硅膠填充柱來(lái)分離這一類化合物,線性范圍為1～100mg/L。Mayer等報(bào)道了農(nóng)藥Cinosulfuron及其副產(chǎn)物的毛細(xì)管電色譜的分離分析。游靜等[23]對(duì)毛細(xì)管電泳在農(nóng)藥手性拆分的進(jìn)展做了綜述。4.8CE用于純度檢測(cè)CE在國(guó)外分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及生物工程藥廠里已廣泛用作最有效的純度檢測(cè)手段。當(dāng)?shù)鞍椎氖杷韵嘟鼤r(shí),它們?cè)贖PLC柱中往往同時(shí)流出,因此在對(duì)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究(包括N端序列和肽譜)之前,必須監(jiān)測(cè)從HPLC所得肽片斷的純度。快速CE純度檢測(cè)可節(jié)約樣品和節(jié)省序列測(cè)定所需時(shí)間。因CE和RP2HPLC分離機(jī)理不同,所以當(dāng)用CE檢查由RP2HPLC純化制得的某一合成肽(一個(gè)峰,純度為99.12%)時(shí),發(fā)現(xiàn)分出6個(gè)組分,主峰純度僅為50%?；蛟S這就是部分基因工程產(chǎn)品用HPLC檢測(cè)純度很高而實(shí)際生物活性卻各批差異很大的一個(gè)原因。至于用CE對(duì)藥廠生產(chǎn)及QC作純度檢測(cè)的應(yīng)用實(shí)例比比皆是,如對(duì)胰島素、白細(xì)胞介素、人生長(zhǎng)激素、粒性巨噬細(xì)胞菌落刺激因子(用CIEF)等的檢測(cè)。純度檢測(cè)時(shí)用CE可檢測(cè)出多肽鏈上單個(gè)氨基酸的差異。CE用于純度檢測(cè)可用CZE,MECC,SDS2CGE,CIEF多種模式。還有文獻(xiàn)討論了用不同方法(包括RP2HPLC,IEC2HPLC,SDS2PAGE及CE)進(jìn)行純度檢測(cè)的最有效的策略[24]。5結(jié)論作為一種蛋白質(zhì)、多肽、核酸及其他生物分子