實驗?zāi)c道致病菌分離鑒定

實驗?zāi)c道致病菌分離鑒定第一頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二錄像：球菌操作：1、化膿性球菌分離鑒定（二）（1）革蘭染色（2）轉(zhuǎn)種甘露醇或血清肉湯（3）血漿凝固酶實驗（4）觸酶實驗

2、腸道菌分離鑒定（一）

——糞便標(biāo)本接種S.S平板材料：（1）載玻片1-2張/人（2）甘露醇或血清肉湯1支/人（3）新鮮兔血漿、生理鹽水各1支/6人（4）S.S平板1塊/人（5）糞便標(biāo)本：傷寒、痢疾、副甲、副乙1套/教室實驗內(nèi)容第二頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二了解：腸道致病菌的血清學(xué)鑒定

觸酶實驗、血漿凝固酶實驗的原理掌握：

1.腸道致病菌分離鑒定的方法、步驟及生化反應(yīng)

2.化膿性球菌轉(zhuǎn)種甘露醇或血清肉湯的目的

3.觸酶、血漿凝固酶實驗的結(jié)果觀察[教學(xué)目標(biāo)]第三頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二觀察上次實驗結(jié)果、進(jìn)行分析紫外線殺菌實驗第四頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二抗生素敏感試驗

抑菌圈直徑第五頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二

如果細(xì)菌對藥物敏感，則在藥片周圍有抑菌圈形成，敏感度越高抑菌圈直徑越大：

>20mm：極度敏感

5-20mm：中度敏感

10-15mm：輕度敏感

<10mm:不敏感無抑菌圈:耐藥第六頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二化膿性球菌分離鑒定（二）

膿汁血平板菌落葡萄狀排列鏈狀排列血漿凝固酶實驗甘露醇發(fā)酵實驗血清肉湯管接種三線法37℃24h革蘭染色觸酶實驗排列不典型第七頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二2、操作革蘭染色及鏡檢觸酶實驗血漿凝固酶實驗轉(zhuǎn)種甘露醇或血清肉湯第八頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二

涂片：先在玻片上放一滴生理鹽水，然后刮取菌落在鹽水中乳化，涂成直徑約為1.0cm的膜。干燥：最好在室溫中自然干燥，也可在遠(yuǎn)離火焰上方微微烘干。但切勿靠火焰以免烤焦標(biāo)本。固定：火焰固定。革蘭染色過程：初染：結(jié)晶紫1分鐘媒染：碘液1分鐘脫色：95%酒精半分鐘復(fù)染：稀釋復(fù)紅半分鐘鏡檢：球陽桿陰陽紫陰紅

（1）革蘭染色第九頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二葡萄球菌鏈球菌第十頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二H2O2catalase2H2O+O2（2）觸酶實驗原理：產(chǎn)生過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和分子氧出現(xiàn)氣泡。操作步驟：

在潔凈玻片上滴一滴生理鹽水，用接種環(huán)取少許細(xì)菌培養(yǎng)物與生理鹽水中乳磨均勻，然后加3％過氧化氫數(shù)滴；或直接滴加3％過氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。第十一頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二結(jié)果觀察：有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性。不產(chǎn)生氣泡者為陰性。G+球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，而鏈球菌屬為陰性，故此試驗常用于G+球菌的初步分群第十二頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二（3）血漿凝固酶試驗

1）原理

致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，在血漿中激活劑的作用下，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白，導(dǎo)致血漿凝固；而非致病性葡萄球菌由于不產(chǎn)生此酶，故不能凝固血漿，二者可據(jù)此予以區(qū)別。第十三頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二2）操作：玻片法取干凈玻片一塊血漿及生理鹽水各一滴，分別置于玻片兩端用接種環(huán)取細(xì)菌少許，分別與生理鹽水及血漿充分混勻結(jié)果觀察：30秒鐘內(nèi)鹽水中的細(xì)菌呈均勻渾濁，而兔血漿則呈塊狀或顆粒狀者為陽性。第十四頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二（4）甘露醇試驗或血清肉湯接種

1）甘露醇發(fā)酵試驗：

接種甘露醇單糖管，觀察顏色改變及氣體產(chǎn)生情況。發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸者，使酸堿指示劑（溴麝香草酚蘭）在酸性環(huán)境下由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。

2）接種血清肉湯：觀察細(xì)菌生長狀態(tài)沉淀生長？混濁生長？部分沉淀，上清液混濁生長？第十五頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二腸道菌分離鑒定（一）

腸道桿菌是一大群寄居在人類和動物的腸道中的生物學(xué)性狀近似的革蘭陰性的桿菌，該類細(xì)菌無芽胞，多數(shù)有周鞭毛。需氧或兼性厭氧，能分解葡萄糖及其他碳水化合物，產(chǎn)酸、有些產(chǎn)氣。多數(shù)腸道菌是腸道的正常菌群，當(dāng)宿主免疫力降低或侵入腸道外等部位時，也可成為條件致病菌引起疾病。有的腸道桿菌例如傷寒沙門菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌等，是腸道致病菌，可導(dǎo)致人類某些腸道傳染病。第十六頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二

腸道菌的種類繁多，為成功地檢出病原菌，通常選用選擇或鑒別培養(yǎng)基。除提供細(xì)菌生長所需營養(yǎng)物外，還含有抑菌劑和指示劑?？捎羞x擇性抑制某些腸道細(xì)菌的生長，指示劑則能鑒別細(xì)菌的生化特性。

本次試驗以糞便為標(biāo)本進(jìn)行腸道菌的分離鑒定。糞便標(biāo)本中含有傷寒桿菌、副傷寒桿菌、痢疾桿菌以及大腸桿菌等腸道菌，要求從標(biāo)本中分離出單一的致病菌，并通過后續(xù)的試驗鑒定出致病菌。第十七頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二S.S瓊脂培養(yǎng)基中含有膽鹽、煌綠和枸櫞酸鈉等成分，不僅能抑制G+菌的生長，也能抑制腸道非致病菌的生長。S.S瓊脂培養(yǎng)基大腸桿菌在此平板上生長，可分解培養(yǎng)基中乳糖產(chǎn)酸，與膽鹽作用形成膽酸沉淀，使中性紅指示劑變紅，形成紅色渾濁不透明菌落。腸道致病菌則不分解乳糖，形成無色或淡黃色菌落（因分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生堿性物質(zhì)）。第十八頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二SS瓊脂培養(yǎng)基（Salmonella-Shigellaagar）

大腸埃希菌沙門菌志賀菌第十九頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二操作：糞便S.S.平板挑選可疑菌落培養(yǎng)24h37℃接種三線法腸道菌分離鑒定（一）第二十頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二1、用無菌接種環(huán)挑取少量糞便標(biāo)本，用劃線法接種于S.S平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)。2、放置于37oC孵箱內(nèi)培養(yǎng)18-24