實驗一一培養(yǎng)基的制備與滅菌

實驗一一培養(yǎng)基的制備與滅菌第一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二實驗要求課前充分預習，上課不無故缺席，實驗報告要及時上交。實驗期間不得大聲喧嘩、服從老師的安排、注意安全。實驗器材專人專用，對儀器要愛護，損壞實行賠償制度。實驗菌種和物品未經(jīng)許可，不得攜出室外，用后的菌種按老師要求妥善處理。維護好實驗室的環(huán)境衛(wèi)生，實行值日生制度。第二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二實驗報告要求統(tǒng)一用A4紙手寫實驗報告封面格式1、實驗課程名稱2、實驗項目名稱3、學生所在的專業(yè)、班級、姓名、學號4、實驗日期5、同組者姓名第三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二實驗報告格式

1、實驗目的2、實驗原理3、實驗儀器、溶液試劑4、實驗步驟5、實驗結果（如繪圖、列表等）6、思考題第四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二實驗成績的組成

平常成績30％（實驗操作表現(xiàn)、實驗報告）操作考試30％筆試成績40％第五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二實

驗

內(nèi)

容土壤中微生物的分離純化與活菌計數(shù)顯微鏡的使用及酵母菌、放線菌的形態(tài)觀察霉菌的形態(tài)觀察油鏡的使用、細菌的單染色和革蘭氏染色微生物大小測定、顯微鏡直接計數(shù)法微生物生理生化反應水中細菌總數(shù)和總大腸菌群的測定微生物的紫外誘變第六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二（一）培養(yǎng)基的制備與滅菌實驗一、土壤中微生物的分離純化與活菌計數(shù)第七頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二一、培養(yǎng)基的制備目的要求明確培養(yǎng)基的配制原理通過對基礎培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟第八頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二按培養(yǎng)基的用途分基礎培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基按成分不同分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基基本原理第九頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二培養(yǎng)基的配方牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（一種天然培養(yǎng)基，用于分離和培養(yǎng)細菌）

配方：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g瓊脂20g水1000mlpH7.2-7.4滅菌121℃20min

第十頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二高氏Ⅰ號培養(yǎng)基（一種合成培養(yǎng)基，可用于培養(yǎng)放線菌）

配方：可溶性淀粉20gKNO31gNaCl0.5gK2HPO40.5gMgSO40.5gFeSO40.01g瓊脂20g水1000mlpH7.2～7.4滅菌121℃20min

第十一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二固體淀粉培養(yǎng)基（一種鑒別培養(yǎng)基，用于大分子物質(zhì)水解的生理生化鑒定）配方：蛋白胨10g氯化鈉5g牛肉膏5g可溶性淀粉2g蒸餾水1000ml瓊脂15～20g

滅菌121℃20min第十二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二器材溶液或試劑

4mol/LNaOH，1mol/LHCl，各類培養(yǎng)基的配方藥品。儀器或其他用具

試管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，藥匙，電磁爐，高壓蒸氣滅菌鍋，pH試紙(pH5.5～9.0)，硅膠塞，棉花，報紙，記號筆等。第十三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二操作步驟（一）1．計算：根據(jù)配方按照用量計算。2.稱量：3．溶解：如有瓊脂，要不斷攪拌避免糊底。4、調(diào)節(jié)pH：用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)，以pH試紙或pH計測定。5．過濾：趁熱用四層紗布過濾。

第十四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二操作步驟（二）6.分裝試管：固體不超過試管高度的1/5；液體、半固體不超過試管高度的1/4或1/3。三角燒瓶：總體積的一半為限。管口或瓶口不得沾有培養(yǎng)基第十五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二操作步驟（三）7.加塞1.正確；2.管內(nèi)部分太短，外部太松；3.外部過小第十六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二操作步驟（三）8.包扎：注明培養(yǎng)基的名稱。9.滅菌

：按各自培養(yǎng)基滅菌的溫度、時間滅菌。10.擱置斜面

(1/3～l/2，不能超過1/2)。11.無菌檢查第十七頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二實驗無菌器皿的準備無菌水：在試管或三角瓶內(nèi)量取實驗所需的自來水，經(jīng)

121℃20min滅菌。無菌移液吸管、培養(yǎng)皿：報紙包扎后，經(jīng)121℃20min滅菌。第十八頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二第十九頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。

目的要求二、消毒與滅菌第二十頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二

滅菌是指殺死一切微生物的營養(yǎng)體，芽孢和孢子。消毒則指消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體，因而只是部分滅菌。消毒與滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過濾、照射和使用化學藥品等方法。

基本原理第二十一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二干熱滅菌火焰灼燒法干熱滅菌法（烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法）濕熱滅菌法加壓蒸汽滅菌法紫外線滅菌法微孔濾膜過濾除菌第二十二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二火焰灼燒法直接在火焰上灼燒滅菌主要用于實驗室接種針(環(huán))、試管口、三角瓶口和金屬小工具等的滅菌。第二十三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二干熱滅菌法設備：電熱烘箱適用于耐高溫器皿，160-170℃，維持2小時注意事項：溫度不可超過180℃，以防玻璃器皿上的棉塞及包裝紙烤焦著火。滅菌時物品不宜堆放得太緊，以免妨礙空氣流通。滅菌物品不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火。電烘箱內(nèi)溫度＜70℃時，方可打開箱門，以免驟然降溫導致玻璃器皿炸裂。第二十四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二2.濕熱滅菌(一）高壓蒸汽滅菌法：是將物品放在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)0.1MPa，121℃保持15～30min進行滅菌，從而導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。時間的長短可根據(jù)滅菌物品種類和數(shù)量的不同而有所變化，以達到徹底滅菌為準。此法適用于培養(yǎng)基、工作服、橡皮物品等的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。第二十五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。原因一：濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低。卵白蛋白含水量/%30分鐘內(nèi)凝固所需溫度/℃50562574~801880~9061450160~170蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關系第二十六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二原因二：濕熱的穿透力比干熱大。原因三：濕熱的蒸氣有潛熱存在。

溫度/℃時間/h透過布層的溫度/℃

滅菌干熱130~1404867270.5不完全濕熱105.33101101101完全第二十七頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二

在同一壓力下，含有空氣的蒸汽所達到的溫度低于飽和蒸汽的溫度，所以排氣是否完全很重要。第二十八頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二間歇滅菌法：

應用于不易于高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等。此法是用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進行滅菌，每天加熱100℃30min、連續(xù)三天，可徹底滅菌。煮沸消毒法：注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般煮沸消毒時間為10～15min。超高溫殺菌：

此法指在溫度和時間標準分別為135～150℃和2～8s的條件下對牛乳或其他液態(tài)食品進行處理的一種工藝。2.濕熱滅菌(二）第二十九頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二高壓蒸汽滅菌法操作步驟（三）第三十頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二手提式高壓蒸汽滅菌鍋第三十一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二全自動數(shù)顯立式高壓蒸汽滅菌鍋第三十二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二操作步驟（三）（以手提式高壓蒸汽滅菌鍋為例）

1.裝鍋先向外層鍋內(nèi)加入適量的水，放入內(nèi)鍋，裝入待滅菌物品。2.加蓋將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，勿使漏氣。3.滅菌加熱，并同時打開排氣閥，待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，升溫至l21℃時維持15~20min。4.降溫取物

滅菌結束后，切斷電源，當壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，開蓋取物。第三十三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二加壓蒸汽滅菌法0.1MPa，121℃，20min滅菌注意事項：切勿忘記加水，加水量不可過少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關上排氣閥，維持所需壓力。壓力一定要降到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物。滅菌全程必須有人看守。第三十四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二紫外線滅菌法適用于無菌室、接種箱、手術室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。紫外線燈距照射物以不超過1.2m為宜。若紫外線照射與3%~5%的石炭酸溶液或2%~3%的來蘇爾等化學消毒劑結合使用，可加強滅菌效果。注意事項：紫外線對眼結膜及視神經(jīng)有損傷作用，對皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光，更不能在紫外線燈光下工作。第三十五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二過濾除菌法適用于不耐熱的液體物質(zhì)（如維生素、血清、酶等熱敏性物質(zhì)）。濾膜孔徑：≤0.22μm缺點：無法去除培養(yǎng)液中的病毒和噬菌體。第三十六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期二思考題培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的？在配制培