實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)第一頁，共十五頁，編輯于2023年，星期二一實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A裂解法分離質(zhì)粒DNA的基本原理和操作要點(diǎn)。了解限制性內(nèi)切酶作用的原理、特點(diǎn)和酶切質(zhì)粒DNA的試驗(yàn)方法學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)

質(zhì)粒是一種染色體外能夠穩(wěn)定遺傳的因子，具有雙鏈共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA分子。是染色體外小型（1-200kb）的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。

二實(shí)驗(yàn)原理第二頁，共十五頁，編輯于2023年，星期二

培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增收集和裂解細(xì)菌分離和純化質(zhì)粒DNA

共價(jià)閉環(huán)DNA（cccDNA）線狀DNA（lcDNA）開環(huán)DNA（ocDNA）

三個(gè)基本步驟質(zhì)粒存的形態(tài)第三頁，共十五頁，編輯于2023年，星期二堿裂解法利用宿主菌巨大線狀染色體DNA與相對(duì)較小的閉環(huán)雙鏈質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)的差異來提取質(zhì)粒DNA。堿變性DNA時(shí)，線狀基因組DNA變性充分而質(zhì)粒DNA處于拓?fù)淅p繞的自然狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)去除變性條件時(shí)（酸中和），質(zhì)粒DNA迅速準(zhǔn)確配置重新形成完全天然超螺旋狀分子，而難于復(fù)性的長(zhǎng)鏈線狀的基因組DNA則與破裂的細(xì)胞壁、細(xì)菌蛋白相互纏繞成大型復(fù)合物，被SDS包蓋，當(dāng)K+取代Na+時(shí)這些復(fù)合物會(huì)從溶液中沉淀下來，附在細(xì)胞碎片上一起被離心除去。第四頁，共十五頁，編輯于2023年，星期二質(zhì)粒檢測(cè)：

電泳檢測(cè)：質(zhì)粒電泳一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。

吸光值檢測(cè)：采用分光光度計(jì)檢測(cè)260nm、280nm波長(zhǎng)吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之間，說明質(zhì)粒質(zhì)量較好，1.8為最佳，低于1.8說明有蛋白質(zhì)污染，大于1.8說明有RNA污染。第五頁，共十五頁，編輯于2023年，星期二Ⅱ型酶識(shí)別的DNA序列一般含有4～6個(gè)核苷酸。有的在識(shí)別順序的對(duì)稱軸上對(duì)雙鏈DNA同時(shí)切割產(chǎn)生平末端；有的在識(shí)別順序的雙側(cè)末端DNA雙鏈產(chǎn)生粘性末端。Ⅱ型限制性內(nèi)切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ型酶所識(shí)別的序列具有反向?qū)ΨQ的結(jié)構(gòu)，或稱為回文結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒DNA通常都具有一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切識(shí)別序列，可被相應(yīng)限制性內(nèi)切酶切出相應(yīng)數(shù)量的切口，從而產(chǎn)生相應(yīng)數(shù)量的酶切片斷。本實(shí)驗(yàn)采用的EcoRⅠ和Hind的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)分別為

GAATTC和AAGCTTCTTAAGTTCGAA

第六頁，共十五頁，編輯于2023年，星期二DNA在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。

在堿性環(huán)境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是呈離子化狀態(tài)的，把這些核酸分子放置在電場(chǎng)當(dāng)中，它們就會(huì)向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系，可以近似用于估算分子的大小?？梢苑蛛x相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。共價(jià)閉環(huán)超螺旋DNA＞直線DNA＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。第七頁，共十五頁，編輯于2023年，星期二DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNA的構(gòu)象、所加電壓、電場(chǎng)方向、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間第八頁，共十五頁，編輯于2023年，星期二接含質(zhì)粒的單菌落于2mlLBAmp+液體培養(yǎng)基中370C，190rpm振蕩培養(yǎng)過夜取2.0mL菌液入2.0ml的dorf管中5000rpm、離心5min，棄上清，收集菌體200uL溶液I+5uLRNA酶懸浮菌體（充分混勻），冰上靜置5min

加入400uL溶液II（輕輕混勻），室溫靜置5min裂解菌體加入300uL溶液III（輕輕混勻），冰上靜置5min質(zhì)粒DNA復(fù)性三實(shí)驗(yàn)步驟

第九頁，共十五頁，編輯于2023年，星期二4℃，10000rpm，離心10min，取700μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管加700μL的氯仿：異戊醇［V:V＝24:1］（混勻），冰上靜置5min4℃，10000rpm，離心10min，取500μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管

加1.0mL無水乙醇（充分混勻），-20℃放置20min4℃，10000rpm，離心10min

，棄上清加入500μL70%乙醇，將沉淀懸起

4℃，5000r/min離心5min，棄上清（用軟紙將管內(nèi)乙醇吸干）即可。第十頁，共十五頁，編輯于2023年，星期二取實(shí)驗(yàn)一中提取的質(zhì)粒，向其中加入10μL滅菌的雙蒸水使其充分溶解，測(cè)定其dsDNA濃度。然后按下表進(jìn)行操作：實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組(不做）Buffer40EcolⅠ30HindⅢ30質(zhì)粒XXddH2O10-X20-X總體積2020充分混勻后于37℃保溫2-3h。（注最終反應(yīng)體系中質(zhì)粒濃度至少達(dá)到1.2μg/μL）第十一頁，共十五頁，編輯于2023年，星期二第十二頁，共十五頁，編輯于2023年，星期二三實(shí)驗(yàn)步驟

制膠

——1.0％瓊脂糖凝膠(50ml)

凝膠板的制備

——小心加入2－3μlEB，搖勻（污染EB吸頭，不宜再回收使用）

點(diǎn)樣——樣品20μl，與4μl溴酚蘭混勻(DNAmaker3μl加入10μl水與4μl溴酚蘭混勻)電泳——穩(wěn)壓80v，DNA向陽極移動(dòng),大約50-60min

觀察和拍照——