非條件反射焦慮模型制作的具體步驟及方法

非條件反射焦慮模型制作的具體步驟及方法一、探究行為焦慮模型大鼠高架十字迷宮實驗（elevatedplusmazetestinrats）⑴復(fù)制方法健康雄性大鼠，體重為200?250g。十字迷宮裝置一般為木制結(jié)構(gòu)并漆成黑色。包括2個50cmx50cm的相對開臂和2個50cmx10cmx40cm的相對閉臂。閉臂上部敞開，中央有一10cmx10cm的開闊部。2個開臂和2個閉臂呈十字交叉迷宮離開地面的高度為50cm,故稱高架十字迷宮。將大鼠置于中央開闊部，面向其中的一個閉臂。觀察者在1.0m以外記錄5min內(nèi)大鼠進入開臂和閉臂的次數(shù)以及在兩臂滯留的時間（以四肢全部入臂或出臂為準）。計算大鼠進入開臂的次數(shù)和時間分別占總次數(shù)（兩臂次數(shù)之和）和總時間（在兩臂滯留時間之和）的百分比，以此作為評價焦慮的指標。通常這2個指標呈高度相關(guān)。為了減少無關(guān)刺激對實驗的影響，在實驗前5?7d每天撫摸動物，并于實驗前先將大鼠置于一敞箱中活動5min，然后再放入迷宮進行實驗。這樣可提高大鼠入臂的總次數(shù)，避免大鼠躲在閉臂，增加實驗的準確性。⑵模型特點此模型是利用動物對新異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成的矛盾沖突狀態(tài)，由Montgomery的研究工作發(fā)展而來的。大鼠放入迷宮后會主動探究開臂，但又懼怕開臂中高懸敞開的環(huán)境?？菇箲]劑增加大鼠進入開臂次數(shù)的百分比和在開臂滯留時間的百分比，但不改變?nèi)吮劭偞螖?shù)和總時間；致焦慮劑則在不影響總次數(shù)和總時間的劑量下使這2項指標減少。(3)比較醫(yī)學(xué)此實驗操作簡便，評價抗焦慮作用的結(jié)果可靠，但比較費時。此方法也可用于小鼠，并可得到與大鼠一致的結(jié)果。大鼠開場實驗(openfieldtestinrats)(1)實驗方法Stefanski法復(fù)制方法實驗裝置為1只直徑80cm、高30cm的圓形敞箱，敞箱底部中央劃有直徑分別為35cm和50cm的內(nèi)、外兩個圓圈，內(nèi)圈所包含的區(qū)域為中央?yún)^(qū)。將大鼠置于中央?yún)^(qū)，觀察10min內(nèi)大鼠總的活動次數(shù)、進入開場中央的次數(shù)以及在開場中央?yún)^(qū)停留的時間。實驗在弱光照明、65dB白噪聲的條件下進行。開場飲水實驗(openfielddrinktest)復(fù)制方法實驗裝置為1只36cmx36cmx36cm的透明有機玻璃方箱，頂部敞開，箱的左、右、后三側(cè)面及底部均為黑色，前側(cè)面無色透明以便觀察。箱的中央倒置懸掛一水瓶，瓶嘴離地面10cm箱的上方離地面60cm處安置一盞25W的白熾燈。實驗前3d大鼠限制飲水，每天僅于下午3:00?4:00給予飲水1h。同時需每天撫摸大鼠1min，以減少非特異性應(yīng)激對實驗的影響。實驗時將大鼠置于開場中央，觀察動物開始飲水的潛伏期、飲水時間、靠近水瓶的次數(shù)和站立數(shù)等指標，觀察持續(xù)時間為10min。在每只大鼠實驗后，需清潔實驗箱，以防止嗅覺暗示影響下一只實驗鼠。模型特點動物進入敞箱后由于對新異環(huán)境具有恐懼心理，因此主要在敞箱內(nèi)的周邊區(qū)域活動。但動物的探究特性又促使其產(chǎn)生在中央?yún)^(qū)域活動(如運動、飲水或進食等)的動機，因而形成沖突狀態(tài)。與大鼠高架十字迷宮實驗結(jié)果類似，抗焦慮劑可解除這種沖突狀態(tài)，在不改變活動計數(shù)的劑量下明顯增加大鼠進入敞箱中央?yún)^(qū)域的次數(shù)以及在中央?yún)^(qū)域停留的時間(Stefanski法)，或增加大鼠在中央?yún)^(qū)域的飲水時間(openfielddrinktest)，致焦慮劑則反之。比較醫(yī)學(xué)開場實驗設(shè)備簡單、操作容易，因此在行為學(xué)研究中已普遍應(yīng)用，多用來評價動物的運動活性等綜合行為。而作為抗焦慮模型，其穩(wěn)定性和可靠性還需進一步驗證，因此實驗者I好結(jié)合其他的焦慮模型綜合評價藥物的效應(yīng)。明暗穿箱實驗(light-darktransitiontest)⑴復(fù)制方法明暗穿箱實驗可分別采用大鼠和小鼠進行實驗，其原理相似。1)大鼠明暗穿箱實驗明暗箱(45cmx27cmx27cm)分明箱和暗箱2個部分。暗箱占1/3，頂部加蓋；明箱占2/3，頂部敞開，亮光照明。兩箱之間的隔板底部有一個7.5cmx7.5cm的門洞供動物穿過。明暗箱與動物活動計數(shù)儀相連，可同時記錄動物的運動活性。動物給藥后時間將其置于明箱中央，背對洞口，記錄10min內(nèi)動物的穿箱次數(shù)以及分別在明箱和暗箱的滯留時間。2)小鼠明暗穿箱實驗此處介紹一種Shimada改良法。Shimada明暗箱的結(jié)構(gòu)為：在1只40cmx40cmx12cm的有機玻璃箱中央安裝一個20cmx20cmx12cm的透明有機玻璃小敞箱，在小敞箱的2個對角分別連有一個10cmx10cmx12cm的暗箱，暗箱的兩側(cè)各連有一個L型的跑道，暗箱與L型的跑道有一個3.5cmx3.5cm的洞口相通。裝置上方裝有攝像系統(tǒng)并連接視屏分析系統(tǒng)，以觀察小鼠的穿箱次數(shù)、在明箱滯留時間及運動活性。實驗時使小鼠背對暗箱的洞口，記錄10min內(nèi)小鼠的穿箱次數(shù)及分別在明暗箱的滯留時間。模型特點此實驗是根據(jù)大鼠或小鼠喜歡在暗箱活動，但動物的探究習(xí)性又促使其試圖探究明箱而設(shè)計的。然而"明箱的光亮刺激又抑制動物在明箱的探究活動?？菇箲]作用可增加動物在明箱的站立、滯留時間和運動活性，增加穿箱次數(shù)，同時動物在暗箱的上述指標相應(yīng)減少，穿箱次數(shù)也減少。比較醫(yī)學(xué)有抗焦慮作用的藥物均可增加動物的穿箱次數(shù)及在明箱的滯留時間、站立和運動活性，非抗焦慮劑則無此作用。在此模型上抗焦慮劑的相對作用強度與臨床試驗結(jié)果一致。此方法具有簡便易行、對動物施加的是無痛性刺激的優(yōu)點。缺點為所需時間漫長，早上和下午動物的活動性差異較大，建議實驗放在下午進行。小鼠爬梯實驗(staircasetestinmice)⑴復(fù)制方法選用雄性小鼠，體重為18?22g。實驗裝置為一有機玻璃箱：長45cm、寬10cm、一端高12.5cm、另一端高25cm,箱內(nèi)有5級高2.5cm、寬10cm的相同樓梯。實驗時將小鼠置于箱的底部，使其背朝樓梯，記錄3min內(nèi)小鼠的站立數(shù)和爬梯數(shù)(以四肢都爬上樓梯為準)。實驗需在安靜、光線恒定的環(huán)境下進行。⑵模型特點此種方法篩選抗焦慮藥簡便易行，結(jié)果可靠，且由于小鼠的成本較低，因此實用于大規(guī)模篩選。為了簡化觀察，不需考慮動物下樓梯的級數(shù)。每只動物實驗結(jié)束后需清潔實驗箱似排除嗅覺暗示對下一只動物的干擾。⑶比較醫(yī)學(xué)爬梯實驗用于探討動物探索性行為或活動性，動物的爬梯作為評價動物探究行為或活動性的指標，而直立則作為動物焦慮狀態(tài)的參數(shù)?？菇箲]劑在不減少爬梯數(shù)的劑量使站立數(shù)減少，從而使這2個指標分離。此外，能產(chǎn)生與藥物性焦慮變化無關(guān)的運動失調(diào)的藥物也可減少站立數(shù)，但同時也減少爬梯數(shù)。氟哌啶醇、抗抑郁藥以及其他能引起運動失調(diào)的藥物即可減少站立數(shù)，又可減少爬梯數(shù)。致焦慮劑并不產(chǎn)生與抗焦慮劑相反的結(jié)果，故評價致焦慮藥物時宜慎重。小鼠四板實驗(fourplattestinmice)⑴復(fù)制方法選用雄性小鼠，體重為18?22g。實驗裝置為1只25cmx18cmx16cm的長方形箱，箱的底部有4塊8cmx11cm的相同金屬板，各板間均有一4mm寬的間隙，4塊板均與電刺激器相連，處于對角線的2塊板同極，使小鼠每當(dāng)跨越上下或左右金屬板時受到一次電擊，電流強度為0.20?0.8mA。給藥后時間將小鼠置于板上，讓其探究15s后打開電刺激器。當(dāng)小鼠受到電刺激時產(chǎn)生明顯的逃避反應(yīng)，通常穿過2塊到3塊板便會停下，計為1次。記錄10min內(nèi)每分鐘的電擊數(shù)。⑵模型特點四板法以被動回避為基礎(chǔ)，小鼠渴望探究，但又因害怕足電擊而使探究活動受到抑制?？菇箲]劑可緩解或解除這種抑制狀態(tài)，使小鼠受電擊次數(shù)增多，神經(jīng)松弛劑等非抗焦慮藥則無此作用。(3)比較醫(yī)學(xué)該方法操作簡便，不需訓(xùn)練動物，因此廣泛用于抗焦慮藥物的篩選。然而，有些興I奮I劑(如苯I丙I胺)也可增加懲罰性跨板數(shù)(電擊數(shù))，有些抗焦慮劑反而無效。因此需結(jié)合其他焦慮模型的試驗結(jié)果綜合評價。二、大鼠群居接觸模型(Modelofsocialinteractiontestinrats)⑴復(fù)制方法選用雄性大鼠，體重為200?250g。實驗裝置為1只60cmx60cmx35cm的木箱，箱內(nèi)壁漆成黑色。箱的上部懸掛一盞白熾燈，實驗者可根據(jù)需要調(diào)節(jié)燈的功率大小或懸掛高度。大鼠于實驗前單養(yǎng)5?7d。實驗時按體重相近原則兩兩配對，配對大鼠的體重一般相差不超過15g，配對的2只大鼠藥物處理相同。實驗在4種條件下，分兩階段進行。這4種條件分別是：強光(300lx)照射、弱光(30lx)照射、動物對實驗箱熟悉、動物對實驗箱不熟悉。由此可組合為4種不同的實驗環(huán)境，即強光不熟悉、強光熟悉、弱光不熟悉、弱光熟悉。階段實驗是在大鼠不熟悉實驗箱的條件下，分別測定10min內(nèi)配對大鼠在強光和弱光環(huán)境下的主動接觸時間。主動接觸包括嗅、追、推、踢、騎跨、理毛、爬或鉆、扭打、格斗等，而被動的依靠則不計入在內(nèi)。若在箱的側(cè)壁上裝有紅外光電管，還町同時觀察動物的活動數(shù)和站立數(shù)。接著將大鼠單個放在箱內(nèi)，使之在自然光的條件下每天熟悉實驗箱10min,連續(xù)2d。接下來進行第二階段強光和弱光熟悉實驗，觀察時間和指標與階段相同。(2)模型特點此模型是基于大鼠在一個陌生的環(huán)境沒有建立自己的領(lǐng)地，表現(xiàn)出渴望接觸的動機而設(shè)計的。采用新異環(huán)境和強光條件作為致焦慮刺激，從而建立起大鼠群居相互接觸焦慮模型。未經(jīng)藥物處理的大鼠，其主動接觸時間在弱光熟悉多于強光不熟悉，而強光熟悉與弱光不熟悉則介于兩者之間。為了排除群居接觸變化由一般刺激或鎮(zhèn)靜效應(yīng)弓I起的可能性，應(yīng)同時測定動物的運動活性(如開場實驗)。此模型選用小鼠很難達到預(yù)期的效果，因此該方法不適宜選用小鼠。(3)比較醫(yī)學(xué)由于該模型不需要訓(xùn)練動物，也沒有剝奪飲食或外加電擊等惡性刺激，且穩(wěn)定可靠，因此是目前焦慮研究中使用多的模型之一。但不同類型的抗焦慮劑在此模型上的表現(xiàn)不相同。如：BDZ類藥物增加強光或不熟悉環(huán)境下大鼠的主動接觸時間，而在弱光熟悉條件下的作用極小；巴比安類藥物則在4種條件下都使主動接觸增多。這兩類藥物的這種作用差別意義還不清楚。致焦慮劑則減少大鼠的主動接觸時間。此模型的不足之處尚有：①由于使用配對動物，一個動物的行為都嚴格依賴于其配對同伴的行為，因此很難檢測單個動物在行為上的差異。②動物消耗多。三、Vogel沖突實驗(Vogelconflicttest)⑴復(fù)制方法選用雄性大鼠，體重為200?250g。實驗裝置為Model-102型焦慮儀(美國Lafayette儀器公司，由自動計數(shù)器、電刺激器和有機玻璃操作箱三部分組成。操作箱尺寸為45cmx24cmx21cm其底部為不銹鋼柵條，條間距離為1cm。頂部蓋為一網(wǎng)眼狀不銹鋼蓋，頂蓋的一端插入一個水瓶，瓶嘴為不銹鋼材質(zhì)。瓶嘴深入箱內(nèi)6cm,距離底部柵條10cm，并與底部柵條一起通過導(dǎo)線與刺激器相連。瓶嘴外套*緣膠皮，以防大鼠觸及瓶嘴但未舔水時遭受電擊。實驗分兩階段進行。階段為非懲罰飲水訓(xùn)練：大鼠禁水24h后被單獨置于操作箱，讓其充分探究，直到發(fā)現(xiàn)瓶嘴并開始舔水。計數(shù)器自動記錄大鼠在3min內(nèi)的舔水次數(shù)，對舔水少于300次的大鼠予以淘汰。第二階段為懲罰實驗：未被淘汰的大鼠繼續(xù)禁水24h后再次被單獨置于操作箱。經(jīng)過階段的訓(xùn)練，大鼠能很快找到瓶嘴并開始舔水。舔夠20次儀器自動開始計時并給予一次電擊（舔水與電擊次數(shù)之比為20:1）,電擊強度一般為0.2?0.5mA，持續(xù)2S，但大鼠可通過脫離瓶嘴來控制受電擊時間的長短。記錄懲罰期（也是3min）大鼠的舔水次數(shù)。（2）模型特點