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文檔簡介
《藥物分析》課件第十三章
生物制品分析概論1醫(yī)學ppt基本要求掌握:常用的定量分析方法中的色譜分析法。熟悉:該類藥物的質量檢驗的基本程序與方法。了解:生化藥物和基因工程藥物定義、種類和特點。2醫(yī)學ppt基本內容一、概述二、鑒別試驗三、雜質檢查四、含量(效價)測定練習與思考3醫(yī)學ppt
1、生物制品藥物分析有那些特點?2、為什么必須對生物制品進行全程質量控制?問題4醫(yī)學ppt生物藥物(來源和生產方法)生化藥物生物合成藥物生物制品第一節(jié)概述2005年版藥典分為幾部?每部的收載內容?5醫(yī)學ppt生物藥物利用生物體、生物組織或組成生物體的各種成分,綜合運用生物學、生物化學、微生物學、免疫學、物理化學和藥學的原理與方法制得的一大類藥物。6醫(yī)學ppt生物藥物發(fā)展過程:第一代:利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物質與混合成分的粗提取物制劑:魚肝油、胰酶及其腸溶、甲狀腺粉及其制劑等。第二代:根據生物化學和免疫學原理,應用近代生化分離純化技術從生物體制取的具有針對性治療作用的特異生化成分。如:尿激酶、胰島素、人血白蛋白等。第三代:應用生物工程技術生產的天然生理活性物質,以及通過蛋白質工程原理設計制造的具有比天然物質更高活性的類似物,或與天然物質結構不同的全新的藥理活性成分。如:重組人生長激素、重組人胰島素等。7醫(yī)學ppt生化藥物定義:指從動物、植物及微生物提取的,也可用生物-化學半合成或用現代生物技術制得的生命基本物質及其衍生物、降解物以及大分子的結構修飾物等,如氨基酸、多肽、蛋白質、酶、多糖、脂質、核甘酸類。8醫(yī)學ppt生物合成藥物定義:由微生物代謝所產生的藥物和必須利用微生物及其酶轉化反應共同完成的半合成藥物,如:山梨醇、木糖醇、甘露醇、維生素、甾體激素、酶與輔酶類藥物等。9醫(yī)學ppt生物制品定義用普通的或以基因工程、細胞工程、蛋白質工程、發(fā)酵工程等生物技術獲得的微生物、細胞及各種動物和人源的組織和體液等生物材料制備,用于人類疾病預防、治療和診斷的藥品。包括:細菌類疫苗、病毒類疫苗、抗毒素及免疫血清、血液制品、細胞因子、體內及體外診斷制品以及其他活性制劑微生態(tài)制劑:雙歧桿菌10醫(yī)學ppt生物制品的種類和特點根據所采用的材料、制法或用途不同,可分為六類:疫苗類藥物:人用狂犬病疫苗抗毒素及抗血清類藥物:流感全病毒滅活疫苗;抗蝮蛇毒血清血液制品:人血白蛋白重組DNA制品診斷制品其他制品11醫(yī)學ppt由于有效結構或分子量不確定,其結構的確證很難沿用化學藥物或結構已知的生化藥物所常用的方法,還需要生物化學分析如:氨基酸組成、N末端氨基酸序列、肽圖等。大部分生物制品的活性組分均為大分子的生命物質(如蛋白質、多肽、核酸、多糖類等)。組分相同,但相對分子量不同而產生不同的生理活性,因此常需進行相對分子量的測定。(二)生物制品的特點分子量不是定值。生化法結構確證。需檢查生物活性。生物制品對熱、酸、堿、重金屬及pH等變化敏感,各種理化因素的變化易對生物活性產生影響。特別是多肽和蛋白質。除理化分析,還需生物檢定,防止蛋白質失活。要求安全性檢查。生物制品組分復雜,有效成分濃度很低,生物大分子雜質含量比較高,生產工藝復雜,易引入特殊雜質和污染物。如重組乙型肝炎疫苗涉及的安全性檢查包括:細胞外源因子檢查、原液、半成品、成品中有關血清白蛋白殘留量、CHO細胞DNA殘留量檢查、熱原檢查、過敏試驗、異常毒性檢查等。需做效價測定。對于生物制品有效成分的檢測,除應有一般化學方法或理化分析進行有效成分含量測定外,更應根據產品的特異生理效應或專一化反應擬定其專屬性的生物效價測定方法,以表征其所含生物活性成分的含量。例:人凝血酶原復合物的效價測定。12醫(yī)學ppt三、生物制品的全程質量控制生物制品化學性質與生物學性質都很不穩(wěn)定,又易受微生物污染,故對生物制品的均一性、有效性、安全性和穩(wěn)定性等應有嚴格要求,以生產出具有藥理活性高、針對性強、毒性低、副作用小,療效可靠及營養(yǎng)價值高等特點的安全、高效的生物制品。為此,必須進行原材料、生產過程和最終產品的全程質量控制,以確保產品符合質量標準要求。13醫(yī)學ppt生物制品及檢定規(guī)程草案(1952年)生物制品制造檢定規(guī)程(1959年)中國生物制品規(guī)程(2000年)中華人民共和國藥典三部(2005年)收載生物制品101種14醫(yī)學ppt
生物制品品名定義、組成及用途基本要求制造檢定(原液、半成品、成品)保存運輸及有效期使用說明(僅預防類含此項)化學藥品品名化學結構、分子式性狀鑒別檢查含量測定藥典三部各論內容藥典二部各論內容15醫(yī)學ppt生物制品質量控制重點有效成分的同一性、結構確證有效成分的均一性、純度檢查有害物質及殘余雜質等的控制高效、靈敏的生物活性及比活性等實驗方法生物制品質量控制基本方法:鑒別試驗雜質檢查安全性檢查含量測定(生物活性或效價)16醫(yī)學ppt第二節(jié)鑒別試驗依據生物制品的化學結構、理化性質和生物學特點,利用化學法、物理法及生物學方法進行某些特殊反應,或測定某些專屬的理化常數如紫外吸收系數、等電點、電泳遷移率、色譜保留時間和肽圖等,判斷與確證產品的真?zhèn)巍#ㄒ唤M實驗)17醫(yī)學ppt一、理化鑒別法1、化學鑒別法
利用藥物與某試劑在一定條件下反應,生成有顏色的產物或沉淀進行鑒別。如胰島素的沉淀反應。2、紫外分光光度法
蛋白質生物制品主要由芳香族氨基酸側鏈如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸產生紫外吸收。如重組人促紅素最大吸收279nm。3、高效液相色譜法
(主峰保留時間和肽圖的一致性)
例如重組人粒細胞集落刺激因子的肽圖分析18醫(yī)學ppt19醫(yī)學ppt二、生化鑒別法1、酶法利用酶對底物特異性的催化活力,做為酶類生物制品簡便、快速鑒別方法。如尿激酶的鑒別
20醫(yī)學ppt2、電泳法
等電點聚焦電泳、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等。可用于蛋白質類生物制品的鑒別。21醫(yī)學ppt三、生物鑒別法(一)血清學法-體外抗原抗體試驗抗原抗體類生物制品的鑒別抗原抗體在體外結合時,可因抗原物理性狀不同或參與反應的成分不同而出現各種類型的反應,如凝集反應、沉淀反應、中和反應和補體結合反應,即經典血清學反應,在此基礎上,又衍生出免疫擴散、免疫電泳、熒光標記、酶標記等高度敏感的檢測技術。22醫(yī)學ppt(二)生物學法利用生物體對生物制品特定的生物活性的反應為基礎進行供試品的鑒別。例如:小鼠驚厥試驗鑒別胰島素肝素延長血凝鑒別肝素23醫(yī)學ppt第三節(jié)雜質檢查可用來判斷藥品的優(yōu)劣。由于生物制品來自生物體,生物活性特異性強,制造與純化工藝復雜,分子結構常常不確定,有時產品并非單一,極微量雜質可能產生顯著的效應,因此,其雜質檢查顯得尤為重要。主要包括:一般雜質檢查特殊雜質檢查安全性檢查24醫(yī)學ppt
一般雜質檢查氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度、溶液的顏色、水份及干燥失重、熾燒殘渣等。25醫(yī)學ppt一、特殊雜質檢查從原料中帶入或生產工藝中或貯藏過程中引入的雜質根據生物制品的生產工藝特點與產品的穩(wěn)定性,其特殊雜質分為:生物污染物:微生物污染、宿主細胞蛋白、外源性DNA、培養(yǎng)基成分等產品相關雜質:二聚體和多聚體、脫氨或氧化產物、突變物、裂解產物等工藝添加劑:殘余抗生素、蛋白分離劑聚乙二醇、乙醇、佐劑氫氧化鋁,產品穩(wěn)定劑如辛酸鈉、肝素,防腐劑苯酚、硫柳汞,細菌與病毒滅活劑甲醛、戊二醛等。26醫(yī)學ppt(一)宿主細胞蛋白殘留量測定生物制品生產用細胞、工程菌相關的特殊雜質。目的:控制異源蛋白含量以防超量后引起機體免疫反應測定法:酶聯免疫吸附劑測定法-ELISA27醫(yī)學ppt(二)外源性DNA殘留量的檢查測定方法:分子雜交技術基于DNA結合蛋白分析系統實時定量PCR方法28醫(yī)學ppt29醫(yī)學ppt(三)產品相關雜質檢查生物制品在生產制造、分離純化和貯藏保存過程中產生的與產品結構類似的同系物、異構體、突變物、氧化物、聚合體或降解物。常用HPLC法和電泳法。如重組人生長激素中相關蛋白質的測定總相關蛋白質含量不超過10%。30醫(yī)學ppt(四)殘余抗生素的檢查如果生物制品在生產過程中使用了抗生素,則不僅要在純化工藝中除去,而且要在原液檢定中增加殘余抗生素活性的檢測方法。常用方法:抑菌圈測量。結果判定:對照溶液有抑菌圈,陰性對照無抑菌圈,供試品溶液抑菌圈的直徑小于對照溶液抑菌圈的直徑時判斷為陰性;否則為陽性。31醫(yī)學ppt二、安全性檢查(一)熱原檢查法和細菌內毒素檢查法(二)異常毒性檢查(三)過敏試驗
檢查異性蛋白(四)降壓試驗
檢查組胺、類組胺或其他導致血壓下降的物質(五)無菌試驗檢查藥品及敷料是否有活菌的一種方法32醫(yī)學ppt含量測定HPLCSDS效價測定第四節(jié):含量(效價)測定33醫(yī)學ppt常用的定量分析方法及應用理化分析法生化分析法生物檢定法34醫(yī)學ppt理化分析法化學分析方法電化學分析法光譜分析法色譜分析法重量法容量分析法35醫(yī)學ppt比色法
利用樣品與顯色劑發(fā)生現色反應,根據反應產物的顏色強度來測定含量。Elson-Morgan
硫酸軟骨素的比色法測定:在酸性條件下使樣品水解成氨基己糖,再在堿性條件下與乙酰丙酮和二甲氨基苯甲醛反應生成紅色的產物,該產物在525nm處有最大吸收。光譜分析方法36醫(yī)學ppt具體試驗操作:1、制備對照品溶液-鹽酸氨基葡萄糖2、制備供試品溶液-硫酸軟骨素3、反應和測定-縮合反應和比色測定A平為供試品溶液的吸收度As平為對照品溶液的吸收度Ws為對照品溶液的濃度(mg/ml)W為稱樣量(mg)0.8309為校正因子500為稀釋倍數以氨基葡萄糖計≥24.0%37醫(yī)學ppt高效液相色譜法反相高效液相色譜法RP-HPLCReversed-phasehigh-performanceliquidchromatography高效離子交換色譜法HPIECHigh-performanceIon-exchangechromatography高效凝膠過濾色譜法HPGFCHigh-performanceGel-filterchromatography38醫(yī)學ppt反相高效液相色譜法
基本原理:利用ODS或C18等極性較小的鍵合硅膠為填料,以極性較大的methanol-water、CH3CN-H2O為流動相,根據樣品在固定相和流動相中的不同保留行為而實現高效分離的一種方法??梢詰肬V、DAD、FD、ELSD、ECD、MS等作為檢測器,分離化合物范圍廣泛。39醫(yī)學ppt生白能(重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子)的RP-HPLC測定色譜條件色譜柱:TSKODS-120T(150×4.6mm,I.D.,5μm)流動相:(A)0.1%的三氟乙酸,(B)乙腈-1%三氟乙酸(90:10),梯度洗脫檢測波長:214nm柱溫:室溫流速:1.0ml/min40醫(yī)學ppt重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)添加劑(人血白蛋白)生白能的HPLC圖41醫(yī)學ppt高效凝膠過濾色譜法
根據生物藥物的分子量及其極性來對成分進行分離測定,主要用于生化藥物的分離和分子量的測定研究。分離產物可以回收、可以用少量表面活性劑來改善分離效果、可根據化合物的形狀和分子量大小來預測出峰順序。具有簡便、快速、重現性好、樣品用量少等優(yōu)點。42醫(yī)學pptHPGFC法測定重組人腫瘤壞死因子(rh-TNF)衍生物的分子量色譜條件色譜柱:BeckmanSEC3000(300×7.5mm)流動相:0.1mmol/lKH2PO4:0.1mmol/lNa2SO4(1:1)檢測波長:280nm柱溫:室溫流速:1.0ml/min43醫(yī)學pptStandards:醛縮酶-2、血清白蛋白-3、碳酸肝酶-4、抑蛋白酶肽-5Interstandard(IS):右旋糖酐藍-1、酪氨酸-644醫(yī)學ppt二、生化分析法
45醫(yī)學ppt(一)酶法酶法
酶活力測定法—以酶為分析對象
酶分析法—以酶為分析工具或分析試劑酶活力測定法酶催化一定化學反應的能力。測定一個被酶所催化的化學反應速度。酶反應速度以單位時間底物的減少或產物的增加來表示。酶活力46醫(yī)學ppt酶促反應的影響因素(1)底物濃度的影響:選擇Km小的作底物
(2)pH的影響(3)溫度的影響:溫度控制在±0.1度(4)輔助因子的影響(5)空白和對照試驗
空白:雜質反應和自發(fā)反應引起的變化量
對照實驗:用純酶或標準酶制劑測定。用于比較或測定的標準。
47醫(yī)學ppt酶法測定方法(1)取樣測定法停止酶反應的方法:添加變性劑加熱使酶失效(2)連續(xù)測定法48醫(yī)學ppt檢測方法1、UV-VIS—根據產物和底物特征吸收差別2、熒光3、旋光法4、酶偶聯測定法例如:ELASA5、其他:電化學法、離子選擇電極測定等49醫(yī)學ppt酶分析法以酶為分析工具的方法。分析的對象可以是酶的底物、輔酶活化劑或酶抑制劑。影響因素:酶和作用物的濃度、反應時間、溫度和pH50醫(yī)學ppt(二)電泳法生物制品藥物分析的重要手段。在電解質溶液中,帶電粒子或離子在電場作用下,以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移。1、自由界面
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