碩士研究生生物醫(yī)學課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件

中山大學碩士研究生生物醫(yī)學課程轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法聰明出于勤奮，天才在于積累中山大學碩士研究生生物醫(yī)學課程轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法中山大學碩士研究生生物醫(yī)學課程轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法聰明出于勤奮，天才在于積累基因組與蛋白質(zhì)組學技術馬珊珊中山醫(yī)學院藥理教研室中山大學蛋白質(zhì)組學研究中心轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究常用方法1.檢測基因的表達水平：mRNA：RT-PCRProtein：WB，ICC，IHC，IFTranscription：報道基因2.證明轉(zhuǎn)錄因子的功能：增強:overexpression,constitutivelyactivate抑制:inhibitor，dominantnegative,siRNA，KOmice3.導入外源基因方法：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，病毒感染，穩(wěn)定細胞株意義神經(jīng)元凋亡→AD、PD等神經(jīng)退行性疾病信號轉(zhuǎn)導與基因調(diào)控研究－尋找調(diào)控凋亡的關鍵分子揭示神經(jīng)退行性疾病機制并確立新的防治靶點6JNK/c-Jun是神經(jīng)元凋亡的關鍵通路

撤NGF處理交感神經(jīng)元撤鉀處理小腦顆粒神經(jīng)元

β淀粉樣蛋白處理大腦皮質(zhì)神經(jīng)元

黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元凋亡

……78c-Jun的靶基因是什么？

FasL

MolCellBiol2019

MolCellNeurosci2019JCellBiol2019Bim

Neuron2019

Neuron2019

NeurosciLett2019910尋找c-Jun促凋亡靶基因

－基因芯片方法促凋亡靶基因：1凋亡時上調(diào)2Ad-169抑制3促凋亡作用

25K,5K,5K+Ad-169提RNAcDNAAffymetrixgenechipΔ169結(jié)構示意圖腺病毒技術感染率80％各類病毒比較見下表病毒表達系統(tǒng)腺病毒Adenovirus慢病毒Lentivirus腺相關病毒Ad-associatedvirus病毒基因組雙鏈DNA病毒RNA病毒單鏈DNA病毒復制自主復制自主復制復制缺陷是否整合病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時表達病毒基因組整合于宿主基因組，長時間、穩(wěn)定表達病毒基因組整合于宿主基因組，長時間、穩(wěn)定表達感染細胞類型分裂和不分裂細胞分裂和不分裂細胞分裂和不分裂細胞表達豐度高水平表達中水平表達高水平表達表達時間快（1-2天）慢(

2-4天)慢滴度滴度高達1012pfu/ml滴度最高可達109TU/ml滴度最高可達105TU/ml克隆容量可插入高達8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入不超過10kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入不超過5kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性c-Jun靶基因：dp5,puma,caspase-3,atf3,drak215JNK/c-Jun介導dp5表達上調(diào)16

c-Jun直接調(diào)控dp5直接調(diào)控:c-Jun結(jié)合dp5啟動子觸發(fā)dp5表達

確立dp5啟動子核心區(qū)分析dp5啟動子上的TF位點TRANSFAC：

gene-regulation/pub/databases.htmlGenomatixSuite：需注冊ALGGEN：alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi?dirDB=TF_8.3&idCon=135804298400&getFile=resumSearchRes.htmlalggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3Dp5啟動子上有c-Jun結(jié)合的ATF位點dp5啟動子上的ATF位點對其轉(zhuǎn)錄活性是否重要？報道基因ATF位點是dp5上調(diào)的關鍵位點24c-Jun是否直接結(jié)合在dp5啟動子的ATF位點上？25ElectrophoreticMobilityShiftAssay(EMSA)26c-Jun與dp5啟動子ATF位點直接結(jié)合Chromatin

Immunoprecipitation

(ChIP)c-Jun與dp5啟動子ATF位點直接結(jié)合29dp5上調(diào)是神經(jīng)元凋亡所必需30siRNA32JonathanHamLab34ATF位點介導c-Jun靶基因上調(diào)反式作用因子c-Jun/ATF2ATFsiteTTACCTCA36c-Jun異二聚體的靶序列3738394041c-Jun/ATF2形成二聚體42Immunoprecipitation(IP)c-Jun/ATF2介導ATF活性抑制c-Jun或ATF2保護神經(jīng)元凋亡45干擾c-Jun、ATF2抑制神經(jīng)元凋亡46atf-decoy抑制神經(jīng)元凋亡p12ATF-(TTACATCA)-c-Jun/ATF2p12ATF-(GGACATCG)-mut47c-Jun、ATF2協(xié)同促凋亡constitutivelyactivatec-Jun/ATF2二聚體促進神經(jīng)元凋亡51BiFC(BimolecularFluorescenceComplementationAssay)

Chang-DengHuetal.2019,MolCell凋亡時BiFC增多Fos↑→BiFC↓,

Fos↓→BiFC↑54Fos抑制c-Jun/ATF2二聚體形成55Fos保護神經(jīng)元5657轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究常用方法1.檢測基因的表達水平：mRNA：RT-PCRProtein：WB，ICC，IHC，IFTranscription：報道基因2.證明轉(zhuǎn)錄因子的功能：

增強:overexpression,constitutivelyactivate

抑制:inhibitor，dominantnegative,siRNA，KOmice3.導入外源基因方法：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，病毒感染，穩(wěn)定細胞株轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究常用方法4.從源頭尋找差異基因方法：genechip,ChIPonchip,ChIPsequence5.啟動子分析：確立啟動子核心區(qū)預測啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點6.證明轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在啟動子上：EMSA，ChIP7.蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用Co-IP,GST-pulldown,BiFC,FR