醫(yī)學(xué)專題-結(jié)核病細菌學(xué)檢驗的標準化與新技術(shù)進展海淀

結(jié)核病細菌學(xué)檢驗(jiǎnyàn)的標準化與新診斷技術(shù)進展王甦民2012年4月第一頁，共七十四頁。編輯ppt強化(qiánghuà)結(jié)核病實驗室診斷標準化的必要性1、全球結(jié)核病控制的三大挑戰(zhàn)：耐藥結(jié)核病、HIV/艾滋病合并結(jié)核病、移民(yímín)（流動人口）2、我國結(jié)核病疫情依然嚴重3、目前結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)的不足第二頁，共七十四頁。編輯ppt第三頁，共七十四頁。編輯ppt分類(fēnlèi)結(jié)核分枝桿菌屬原核生物界、厚壁菌門、裂植菌綱、放線菌目、分枝桿菌科的分枝桿菌屬，分枝桿菌屬種類甚多，目前已命名的有200多種，一般可分為緩慢生長(shēngzhǎng)和快速生長(shēngzhǎng)兩大類。第四頁，共七十四頁。編輯ppt結(jié)核(jiéhé)分枝桿菌特點結(jié)核菌生長緩慢，在一般培養(yǎng)基上分裂(fēnliè)一代需要10-20小時細胞壁厚度為10~35nm，較一般細菌的細胞壁厚，含有大量脂類，具有堅韌性和疏水性。抗酸性是分枝桿菌的重要特征。第五頁，共七十四頁。編輯ppt結(jié)核病細菌學(xué)檢查的重要(zhòngyào)作用細菌學(xué)檢查(jiǎnchá)是結(jié)核病最客觀、最科學(xué)和最重要診斷方法和流行病學(xué)研究工具。因此結(jié)核病的實驗室檢驗仍然面臨著較多的問題。第六頁，共七十四頁。編輯ppt細菌學(xué)檢驗存在(cúnzài)的問題不易于標準化操作誤差較大（可達到30%）1、個人操作誤差2、標本性狀3、標本來源對結(jié)果的理解差異可影響檢驗結(jié)果對臨床治療(zhìliáo)的參考或指導(dǎo)意義。第七頁，共七十四頁。編輯ppt主要(zhǔyào)的細菌學(xué)檢驗技術(shù)1、痰涂片抗酸染色(rǎnsè)、鏡檢技術(shù)2、分枝桿菌分離培養(yǎng)技術(shù)3、分枝桿菌快速培養(yǎng)技術(shù)4、藥物敏感性實驗技術(shù)5、分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)第八頁，共七十四頁。編輯ppt標準(biāozhǔn)的痰涂片抗酸染色、鏡檢技術(shù)標本的收集，特別是痰標本的采集、保存制片和染色過程的標準化讀片操作的熟練程度和標準化對結(jié)果(jiēguǒ)的理解第九頁，共七十四頁。編輯ppt痰標本(biāoběn)的采集、保存和運送膿樣、干酪樣或膿性粘液樣痰為合格標本，痰量應(yīng)為3-5毫升。難以獲得合格標本時，也應(yīng)進行細菌學(xué)檢查，但應(yīng)注明標本性狀，以供分析結(jié)果時參考。容器上應(yīng)注明與檢驗單一致的病人姓名、編號及日期。不能及時檢驗的痰標本應(yīng)置4C冰箱保存，如需轉(zhuǎn)運(zhuǎnyùn)，外送前要認真核對檢驗單與痰瓶上標注，放在專用的轉(zhuǎn)運(zhuǎnyùn)箱內(nèi)運送。第十頁，共七十四頁。編輯ppt標本(biāoběn)的采集

標本留取方法痰標本的留取應(yīng)在醫(yī)護人員的指導(dǎo)下進行。醫(yī)護人員應(yīng)告知病人如何咳痰，合格的痰標本是深呼吸后，由肺部深處咳出的分泌物，并說明唾液檢出的可能性很小。檢驗人員檢查痰標本的性狀(xìngzhuàng)，并在登記本和檢驗報告單上注明（按干酪痰、血痰、黏液痰和唾液分類登記）。第十一頁，共七十四頁。編輯ppt如何(rúhé)正確留痰

查痰對于結(jié)核病的診斷是非常重要的，通過痰檢可以知道您是否痰中帶菌。如果痰中帶有結(jié)核菌說明您患有肺結(jié)核，具有(jùyǒu)傳染性，應(yīng)該及時遵醫(yī)囑治療。送檢痰標本的質(zhì)量直接影響檢驗結(jié)果的準確性。請您一定按照下列要求和方法留取合格的痰標本。每個痰盒應(yīng)分別留取1～2口痰，請不要將1口痰分開放到2或3個痰盒中。正確的咳痰方法：1、咳嗽前應(yīng)緩慢地深吸氣，吸氣后稍屏氣片刻。2、軀干略向前傾，兩側(cè)手臂屈曲，平放在兩側(cè)胸壁下部，內(nèi)收并稍加力。3、咳嗽時腹肌用力快速收縮，使腹壁內(nèi)陷。一次深吸氣，可連續(xù)咳嗽三聲。4、停止咳嗽后，收縮腹肌將剩余的氣體盡量呼盡。5、重復(fù)緩慢吸氣動作或平靜呼吸片刻，準備再次咳嗽的動作。*注意：部分人如果忽然深吸氣容易誘發(fā)咳嗽，您可以嘗試緩慢或分幾次吸氣，爭取肺泡內(nèi)充分充氣，以增加咳嗽的效率。在這一過程中，要注意動作的連貫性，一氣呵成。同時，也可以叩擊前胸，或由家屬協(xié)助叩擊后背胸壁。這樣震動支氣管內(nèi)的分泌物，能夠增加咳嗽排痰的力度。第十二頁，共七十四頁。編輯ppt直接(zhíjiē)痰涂片檢查法

萋爾-尼爾遜氏（Ziehl－Neelsen）抗酸染色法（熱染法）第十三頁，共七十四頁。編輯ppt細菌學(xué)常規(guī)(chángguī)檢查

—直接涂片法操作(cāozuò)流程涂痰膜自然干燥復(fù)紅加熱初染5分鐘自然干燥鏡檢流水沖洗美蘭復(fù)染30秒鹽酸酒精脫色流水沖洗流水沖洗第十四頁，共七十四頁。編輯ppt載玻片（一）新載玻片必須經(jīng)95%乙醇脫脂，檢查無劃痕后方可使用。（二）一張載玻片只能涂抹1份痰標本。（三）載玻片只允許一次性使用，嚴禁清洗后重復(fù)用于AFB檢查。（四）載玻片正面一側(cè)1/3處標注實驗室序號(如使用的載玻片一端無磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明編號；如使用的載玻片一端有磨砂面，可使用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫)。（五）載玻片正面另一側(cè)2/3中央處均勻(jūnyún)涂抹成面積為10×20mm的卵圓形痰膜。

第十五頁，共七十四頁。編輯ppt染色(rǎnsè)（一）嚴格按照操作規(guī)范完成(wánchéng)染色程序。（二）染色后的痰膜應(yīng)呈均勻亮藍色，無紅色斑塊。（三）將染色后的玻片放置在報紙上，如果透過痰膜不能分辨報紙上的文字，則表明該玻片涂抹過厚，或染色過程有誤。（四）染色后的痰膜脫落部分應(yīng)小于整個涂抹面積的10%。

第十六頁，共七十四頁。編輯ppt（一）為防止抗酸桿菌的交叉污染，嚴禁油鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。（二）仔細觀察300以上的視野。（三）每個工作日，一名鏡檢人員的玻片閱讀量一般不應(yīng)超過25張。（四）連續(xù)(liánxù)閱讀10～12張玻片后，應(yīng)休息20分鐘左右。鏡檢讀片第十七頁，共七十四頁。編輯ppt

痰涂片(túpiàn)抗酸菌濃度與陽性結(jié)果機率檢出菌數(shù)每毫升標本估算菌數(shù)陽性結(jié)果機率0/100或更多視野＜1000＜10％1-2/300視野5000-1000050％1-9/100視野約3000080％1-9/10視野約5000090％（cv）1-9/每視野約10000096.2％（cv）10或更多/每視野約50000099.95％（cv）第十八頁，共七十四頁。編輯ppt

查痰次數(shù)與陽性機率關(guān)系為什么診斷前強調(diào)(qiángdiào)三涂兩培（3S2C）

12345第十九頁，共七十四頁。編輯ppt細菌學(xué)常規(guī)(chángguī)檢查

—直接涂片法顯微鏡檢報告方式：0條/300視野：萋-尼氏抗酸桿菌陰性(yīnxìng)1-8條/300視野：實報菌數(shù)3-9條/100視野：萋-尼氏抗酸桿菌陽性（+）1-9條/10視野：萋-尼氏抗酸桿菌陽性（2+）1-9條/1視野：萋-尼氏抗酸桿菌陽性（3+）10條/1視野：萋-尼氏抗酸桿菌陽性（4+）第二十頁，共七十四頁。編輯ppt細菌學(xué)常規(guī)檢查

—直接(zhíjiē)涂片法注意事項：選擇痰標本中膿性、血樣、干酪樣的部分涂片陽性率較高；一張玻片只涂一份標本，玻片一次性使用，防止交叉污染；打開痰盒、涂抹痰膜時容易產(chǎn)生氣溶膠，應(yīng)注意正確操作和自身防護；石炭酸復(fù)紅初染時必須(bìxū)加溫。第二十一頁，共七十四頁。編輯ppt細菌學(xué)常規(guī)檢查(jiǎnchá)

—直接涂片法優(yōu)點：是直接發(fā)現(xiàn)原菌的檢查方法，適用于痰、尿、便、體液、組織等幾乎一切標本，有重要的臨床診斷價值。是發(fā)現(xiàn)和確定傳染源的重要途徑，是考核和評價療效的重要指標，有重要的流行病學(xué)意義；操作簡便，價格低廉，適于各級實驗室開展；快速，數(shù)小時(xiǎoshí)可報告結(jié)果。第二十二頁，共七十四頁。編輯ppt細菌學(xué)常規(guī)(chángguī)檢查

—直接涂片法缺點：敏感性低：通常每毫升含5000-10000條以上抗酸菌才可得到陽性結(jié)果(jiēguǒ)；特異性較低：只能報告“抗酸菌陽性”，不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌；鏡下只能觀察菌體形態(tài)，不能辨別死、活菌。第二十三頁，共七十四頁。編輯ppt涂片鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng)(xìtǒng)

—室內(nèi)質(zhì)控標本收集、染色液制備、涂片染色程序、顯微鏡鏡檢、顯微鏡的保養(yǎng)和維護、結(jié)果的報告(bàogào)和登記、痰片的分類保存等應(yīng)按照國家參比實驗室的統(tǒng)一標準嚴格進行操作。復(fù)查方式：自查：試驗員當日對已查涂片抽樣復(fù)查。互查：由本實驗室其他試驗員抽查當日10%涂片。第二十四頁，共七十四頁。編輯ppt涂片(túpiàn)鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng)—室間質(zhì)控以現(xiàn)場和非現(xiàn)場督導(dǎo)為主要方式。現(xiàn)場督導(dǎo)：質(zhì)控實驗室人員赴被質(zhì)控實驗室就實驗室布局、安全防護、污染物處理、涂片(túpiàn)染色操作、顯微鏡維護狀況、日常實驗記錄等進行考核和指導(dǎo)，并以盲法、按比例抽取涂片(túpiàn)復(fù)查。非現(xiàn)場督導(dǎo)：防治人員依據(jù)盲法、按比例的原則抽取涂片交實驗室復(fù)查。第二十五頁，共七十四頁。編輯ppt復(fù)檢玻片樣本量1.樣本量估算：盲法復(fù)檢的關(guān)鍵是復(fù)檢結(jié)果(jiēguǒ)能否真正代表被督導(dǎo)實驗室的實際水平。世界衛(wèi)生組織推薦80%靈敏度、100%特異性（針對陰性玻片）、誤差為0的可接受數(shù)量以及95%可信限樣本量表，可以極大地減少樣本量，保證了盲法復(fù)檢在統(tǒng)計學(xué)意義上可以代表被評估實驗室的總體水平。第二十六頁，共七十四頁。編輯ppt復(fù)檢樣本量計算(jìsuàn)表上一年陰性玻片的總數(shù)玻片陽性率2.5%5.0%7.5%10.0%13.0%15.0%18.0%30018512910180675950400217143108867061515002431541148971625270028116712192756554100031818012896766655200037619713510079685650004232081411038069571000044121314210480695720000450215143104826957第二十七頁，共七十四頁。編輯ppt復(fù)檢樣本量計算(jìsuàn)表說明：

a、玻片陽性率：指所有檢測的玻片中陽性玻片的比例（平均陽性率）。b、上一年陰性玻片總數(shù)：每年玻片的總數(shù)減去全年(quánnián)陽性玻片數(shù)。c、抽樣時，當上一年陰性玻片數(shù)量和玻片陽性率不在選擇點，陰性玻片數(shù)值采用區(qū)間上限，玻片陽性率采用區(qū)間下限。第二十八頁，共七十四頁。編輯ppt復(fù)檢結(jié)果(jiēguǒ)評價盲法復(fù)檢的目的不是為了驗證某個病人診斷(zhěnduàn)正確與否,而是評價整個實驗室操作水平。評價的內(nèi)容除了玻片鏡檢結(jié)果存在的誤差之外，還包括檢查標本的質(zhì)量（合格標本與不合格標本的比例）、涂抹的大小和厚度、染色質(zhì)量如何等,以便采取糾正措施，提高實驗室的工作質(zhì)量。第二十九頁，共七十四頁。編輯ppt1.誤差分類：分為定性(dìngxìng)誤差和定量誤差（1）定性誤差包括高假陽性和高假陰性高假陽性（HighFalsePositiveHFP）：陰性片被錯誤地判讀為2＋以上的陽性。高假陰性（HighFalseNegativeHFN）：2＋以上的陽性玻片被錯誤地判讀為陰性。第三十頁，共七十四頁。編輯ppt（2）定量誤差包括量化誤差、低假陽性和低假陰性量化誤差（QuantificationError，QE）：同一張陽性玻片初檢者和復(fù)檢者陽性判斷級別的差異。低假陽性（LowFalsePositive，LFP）：陰性玻片被錯誤(cuòwù)地判斷為1＋及以下的陽性。低假陰性（LowFalseNegative，LFN）：1＋及以下玻片被錯誤地判斷為陰性。第三十一頁，共七十四頁。編輯ppt常見(chánɡjiàn)“誤差”原因誤差類型可能原因建議假陽性（FP）1)例如染料沉渣或結(jié)晶等被誤識為抗酸桿菌2)原始報告后著色的抗酸桿菌退色1）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)。2）對假陽性玻片重新染色并復(fù)檢。假陰性（FN）1）觀察玻片的視野數(shù)量不足2）鏡檢技術(shù)能力差3）染色操作不規(guī)范（抗酸桿菌顏色暗淡、背景對比不足或過高）4）顯微鏡存在問題5）染液質(zhì)量差1、2、3）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)4）現(xiàn)場檢查顯微鏡工作狀態(tài)5）重新購置質(zhì)量合格的染料并重新配制染液量化誤差（QE）1）觀察玻片視野數(shù)量不足2）陽性玻片的分級報告標準掌握差3）鏡檢技術(shù)能力差4）顯微鏡存在問題1.2.3）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)4）現(xiàn)場檢查顯微鏡工作狀態(tài)第三十二頁，共七十四頁。編輯ppt實驗室診斷(zhěnduàn)的新進展1、擴大開展液體培養(yǎng)(péiyǎng)和藥敏試驗2、引入現(xiàn)代分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)3、引入現(xiàn)代免疫學(xué)快速檢測技術(shù)第三十三頁，共七十四頁。編輯ppt1、現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(jiǎncè)主要技術(shù)實時(shíshí)熒光定量PCR環(huán)介導(dǎo)等溫擴增基因檢測(Loopmediatedisothermalamplification，

LAMP)分子線性探針（Hain技術(shù)）(2008WHO推薦)基因芯片技術(shù)GeneXpertMTB/RIF快速診斷技術(shù)第三十四頁，共七十四頁。編輯ppt（1.1）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

PCR誕生于1985年，由美國Muliis等發(fā)明。PCR是一種根據(jù)脫氧核糖核酸（DNA）復(fù)制原理而設(shè)計的體外DNA或核糖核酸（RNA）擴增方法，由高溫變性、低濕退火及適溫延伸等反應(yīng)組成一個周期，經(jīng)過n個周期后，理論上可以獲得2n雙鏈DNA分子(fēnzǐ)，使DNA特定區(qū)段大量擴增。此檢測技術(shù)靈敏度高、特異性強、簡便、快速，但也存在假陰性、假陽性、污染等方面的問題，研究人員對其進行了不懈的研究，使該技術(shù)不斷得到改善，新的PCR及其衍生技術(shù)不斷建立。

第三十五頁，共七十四頁。編輯ppt實時熒光(yíngguāng)定量PCR

實時定量PCR(RealTimeQuantitativePCR)是指在PCR反應(yīng)體系加入熒光基團，利用熒光積累能夠監(jiān)控PCR擴增的每一個循環(huán)，在靶ＤＮＡ擴增的同時可獲得定量的結(jié)果.即在同一個反應(yīng)體系內(nèi)完成擴增和擴增產(chǎn)物的檢測,從而省去了靶ＤＮＡ擴增后復(fù)雜(fùzá)的定量檢測工作。第三十六頁，共七十四頁。編輯ppt實時熒光(yíngguāng)定量PCR該技術(shù)(jìshù)的優(yōu)勢在于其擴增產(chǎn)物的自動和實時檢測,減少了常規(guī)ＰＣＲ產(chǎn)物檢測步驟,也減少了人工判斷結(jié)果的主觀性，提高了結(jié)果的客觀性和可比較性。同時工作效率大大提高。研究發(fā)現(xiàn)，該方法的特異性和敏感性較普通ＰＣＲ有所提高。與Southern雜交和酶促化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測的靈敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。第三十七頁，共七十四頁。編輯ppt（1.2）環(huán)介導(dǎo)等溫擴增基因(jīyīn)檢測

(

Loopmediatedisothermalamplification，

LAMP)檢測是連續(xù)等溫進行的。擴增效率十分高，反應(yīng)靈敏(línɡm(xù)ǐn)。采用4條引物，識別6個位點，特異性強。不需要特殊的試劑與儀器，總費用很低。反應(yīng)不需要開蓋，在一管內(nèi)完成全部檢測。利用Bst酶的鏈置換功能進行反應(yīng)。加入反轉(zhuǎn)錄酶，可以完成ＲＮＡ的一步法檢測。第三十八頁，共七十四頁。編輯pptPurificationforUltraRapidExtraction

(PURE)LAMP方法(fāngfǎ)PURE方法(fāngfǎ)等溫反應(yīng)高擴增效率高特異性實驗周期短(幾乎(jīhū)一個小時)簡單去除核酸擴增抑制因子縮短處理時間Pre-treatmentkitLAMPtestSampleLysisMixtureFilterDNA第三十九頁，共七十四頁。編輯pptLAMP檢測(jiǎncè)陰性(yīnxìng)陽性(yángxìng)不需要離心,等溫,快速

(整個過程只需一個小時)；DNA與SYBRGreen結(jié)合現(xiàn)示綠色，Bst聚合酶于30分鐘到一個小時內(nèi)可將毫微微克/毫升(fg/ml)（或500-100拷貝/毫升）的DNA或RNA擴增到10微克左右。第四十頁，共七十四頁。編輯pptLAMP敏感度101001000NCcopies/reaction模板:純化的TB基因組DNA反應(yīng)(fǎnyìng)條件:67℃,40min第四十一頁，共七十四頁。編輯pptLAMP結(jié)果(jiēguǒ)分析儀器特點：1.LAMP檢測專用，每隔6秒測定反應(yīng)產(chǎn)物的濁度．2.可以設(shè)定相應(yīng)的反應(yīng)條件與檢測要求．3.測定結(jié)果可直接輸入電腦進行實時分析(fēnxī)．4.檢測結(jié)果（圖像等）可以打?。?.可同時檢測32個樣本，８聯(lián)管適用．第四十二頁，共七十四頁。編輯ppt（1.3）、分子(fēnzǐ)線性探針（Hain技術(shù)）

原理：基于PCR擴增的檢測方法。擴增后的產(chǎn)物與預(yù)先固化在膜上的特異性探針雜交，通過顯色反應(yīng)判斷(pànduàn)結(jié)果，可以鑒定TB和NTM、鑒定TB復(fù)合群、快速檢測RIF、INH、EMB、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性第四十三頁，共七十四頁。編輯ppt

GenoType?分支(fēnzhī)桿菌試劑盒系列GenoType?

MTBC（來自于培養(yǎng)標本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種間的鑒定(jiàndìng)）GenoType?

MycobacteriaDirect（來自于病人標本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的鑒定）GenoType?

MycobacteriumCM（來自于培養(yǎng)物的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，非結(jié)核分枝桿菌的鑒定）GenoType?

MycobacteriumAS（來自于培養(yǎng)物的其他非結(jié)核分枝桿菌的鑒定）GenoType?

MTBDRplus（結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥性檢測）GenoType?

MTBDRsl（結(jié)核分枝桿菌乙胺丁醇、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性檢測）第四十四頁，共七十四頁。編輯ppt技術(shù)設(shè)備TwinCubator?

手工(shǒugōng)雜交儀第四十五頁，共七十四頁。編輯ppt自動操作(cāozuò)-全自動雜交儀GT-Blot?48或GT-Blot?20第四十六頁，共七十四頁。編輯pptGenoTypeMTBDRplus結(jié)果(jiēguǒ)MTBC及其對利福平和/或異煙肼的耐藥性第四十七頁，共七十四頁。編輯ppt

適用于培養(yǎng)物和痰液。檢測快速，對于直接采集的樣本或陽性培養(yǎng)物在數(shù)小時后內(nèi)即可完成檢測；檢測INH單耐藥型TB、MDR和XDR；符合(fúhé)WHO推薦的線性探針分析標準。GenoTypeMTBDRplus/sl–優(yōu)點(yōudiǎn)第四十八頁，共七十四頁。編輯ppt驗證(yànzhèng)數(shù)據(jù)產(chǎn)品目的材料靶點敏感性專屬性對照方法*GenoType?

MycobacteriumCM普通分支桿菌的鑒定陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA97%93,5%測序；生化技術(shù)GenoType?MycobacteriumAS其他菌種的鑒定陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA96%94%測序；生化技術(shù)GenoType?

MTBC結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的菌種區(qū)分陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA100%100%生化技術(shù)；分子遺傳學(xué)方法GenoType?

MTBDRplus結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的鑒定及其對利福平和/或異煙肼的耐藥性直接采集的標本（顯微鏡檢查陽性，經(jīng)過純化）；陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA直接采集的標本RMP:96,8%INH:90,2%固體/液體培養(yǎng)物RMP:98,7%INH:92%直接采集的標本RMP:95%INH:100%固體/液體培養(yǎng)物RMP:100%INH:100%傳統(tǒng)的藥敏試驗(DST)GenoType?

MTBDRsl結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的鑒定及其對氟喹諾酮類和/或氨基糖苷類/環(huán)肽和/或乙胺丁醇的耐藥性直接采集的標本（顯微鏡檢查陽性，經(jīng)過純化）；陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA直接采集的標本氧氟沙星：88,9%阿米卡星/卷曲霉素：75%乙胺丁醇：38,5%固體/液體培養(yǎng)物**氧氟沙星：90,6%阿米卡星/卷曲霉素：84,8%乙胺丁醇：69,2%直接采集的標本氧氟沙星：100%阿米卡星/卷曲霉素：100%乙胺丁醇：100%固體/液體培養(yǎng)物氧氟沙星：100%阿米卡星/卷曲霉素：100%乙胺丁醇：100%傳統(tǒng)的藥敏試驗(DST)GenoType?

MycobacteriaDirect結(jié)核分支桿菌復(fù)合群鳥分支桿菌M.avium、胞內(nèi)分支桿菌M.intracellulare、堪薩斯分支桿菌M.kansasii、瑪爾摩分支桿菌M.malmoense的鑒定經(jīng)純化后的直接采集的標本RNA涂片陽性樣本97,5%涂片陰性樣本83,3%涂片陽性樣本99%培養(yǎng)第四十九頁，共七十四頁。編輯ppt結(jié)論(jiélùn)DNA-Strip技術(shù)系列涵蓋了分枝桿菌菌種鑒定、TB-復(fù)合群的區(qū)分和藥敏試驗。所有檢測都采用通用(tōngyòng)試劑盒和相同的方案進行擴增和雜交。

所有檢測均可在4-5小時內(nèi)完成。本法適用于大樣本量的檢測（每天檢測數(shù)百份樣品）。第五十頁，共七十四頁。編輯ppt（1.4）、基因芯片(jīyīnxīnpiàn)技術(shù)科學(xué)的發(fā)展人類的進步要求進行大規(guī)模基因信息的解析鑒于基因芯片的多種用途和其遠大的發(fā)展前景，不少生命科學(xué)研究機構(gòu)和生物技術(shù)公司都先后參與了這項技術(shù)的研究。據(jù)不完全統(tǒng)計目前僅國內(nèi)就有十多家單位從事該技術(shù)的研究與開發(fā)工作，全世界估計至少有二三十家。它已象半導(dǎo)體技術(shù)一樣成為一個(yīɡè)重要的產(chǎn)業(yè)方向。當前已正被廣泛地應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，包括生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷學(xué)和基因組學(xué)研究。第五十一頁，共七十四頁。編輯ppt什么(shénme)是基因芯片基因芯片指對數(shù)以千記的DNA片段同時進行處理分析的技術(shù)，諸如基因組DNA突變譜和mRNA表達譜的檢測(jiǎncè)等（TrendsinBiotechnology)。該技術(shù)系指將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。第五十二頁，共七十四頁。編輯ppt基因芯片技術(shù)(jìshù)的主要特點技術(shù)操作簡單自動化程高序列數(shù)量大檢測效率高應(yīng)用范圍廣成本(chéngběn)相對低第五十三頁，共七十四頁。編輯ppt博奧分枝桿菌菌種鑒定(jiàndìng)試劑盒(DNA微陣列芯片法)主要分為樣品制備、芯片反應(yīng)和結(jié)果判讀三部分。

首先，將檢測(jiǎncè)菌的DNA從培養(yǎng)、分離純化的菌株或者直接從臨床樣品中提取出來；

然后，對樣品中的靶基因進行擴增和熒光標記；

接著，將擴增并熒光標記的基因序列與芯片上的探針進行雜交反應(yīng)；

最后芯片掃描成像，用配套軟件進行判讀。第五十四頁，共七十四頁。編輯ppt芯片(xīnpiàn)掃描結(jié)果1第五十五頁，共七十四頁。編輯ppt臨床(línchuánɡ)驗證第五十六頁，共七十四頁。編輯ppt（1.5）GeneXpertMTB/RIF快速診斷(zhěnduàn)技術(shù)Cepheid?MTB/RIF:可直接檢測痰液，檢測結(jié)核分支(fēnzhī)桿菌的同時，鑒定是否有利福平耐藥性，2小時出結(jié)果。GeneXpert檢測平臺采用實時熒光定量PCR檢測原理。所有檢測均無需提取核酸，手工操作時間不超過2分鐘。第五十七頁，共七十四頁。編輯pptGeneXpert最大程度簡化(jiǎnhuà)TB檢測?。?！將痰液加入處理瓶，放置15分鐘；將處理后的樣品加入樣品反應(yīng)盒；將該盒子放置在GeneXpert中，輕松按下“開始”鍵；得到結(jié)果（2小時）：檢測是否(shìfǒu)含有結(jié)核分支桿菌的同時，可對利福平耐藥性進行判讀。第五十八頁，共七十四頁。編輯pptXpertMTB/RIF檢測(jiǎncè)操作步驟1、痰液加入處理(chǔlǐ)瓶，放置15分鐘。2、取處理后的痰液2mL加入Xpert反應(yīng)試劑盒3、將反應(yīng)試劑盒放入GeneXpert儀器，點擊“開始”（手工操作至此結(jié)束?。?、自動過濾洗滌樣品5、自動超聲破碎，純化樣品6、熒光定量PCR擴增7、巢氏PCR擴增8、自動結(jié)果判讀（MTB/RIF）第五十九頁，共七十四頁。編輯ppt“Samplein.Answerout.”全自動操作完全封閉系統(tǒng)污染可能性小減少(jiǎnshǎo)人為錯誤結(jié)果精確度高檢測時間短無需(wúxū)專業(yè)技術(shù)人員和特殊實驗室第六十頁，共七十四頁。編輯ppt研究人數(shù)>1,700Patients?秘魯、南非、阿塞拜疆(āsāibàijiānɡ)、印度?涂片陽性(yángxìng)樣品：?靈敏性98.2%,特異性99.2%?涂片陰性,培養(yǎng)陽性樣品：?三次檢測靈敏性90.2%?一次檢測靈敏性72.5%?對利福平耐藥性檢測：?靈敏性97.6%,特異性98.1%第六十一頁，共七十四頁。編輯ppt結(jié)論(jiélùn)GeneXpert檢測Mtb簡單、易于(yìyú)操作，對操作者技術(shù)要求不高：只需要把痰液、反應(yīng)液加入儀器即可得出診斷報告；GeneXpert檢測Mtb快速：整個過程大約2小時。GeneXpert檢測Mtb對操作人員安全：整個檢測過程全封閉、一次性完成。高靈敏性：BCG—176cfu/ml；H57Rv—112cfu/ml耐藥性診斷：可對利福平耐藥性進行檢測第六十二頁，共七十四頁。編輯ppt現(xiàn)代免疫學(xué)診斷(zhěnduàn)技術(shù)1、體液免疫診斷技術(shù)：是利用結(jié)核分枝桿菌或其提取物抗原檢測結(jié)核病患者血清抗體的方法。目前，通過檢測抗結(jié)核桿菌的抗體(IgG)診斷結(jié)核病的商品化試劑盒已較多。采用(cǎiyòng)的方法包括：酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)和免疫金標記技術(shù)的免疫層析法和膠體金標記的滲濾法等，采用(cǎiyòng)的抗原也各不相同。第六十三頁，共七十四頁。編輯ppt體液(tǐyè)免疫學(xué)診斷技術(shù)的意義在國內(nèi)應(yīng)用較廣泛，是結(jié)核病的輔助診斷方法之一,尤其對肺外結(jié)核、菌陰肺結(jié)核的診斷具有應(yīng)用價值。不足之處：單獨使用時，其檢測的特異性和靈敏度都有些缺點。目前國際上反對使用該項技術(shù)(jìshù)的呼聲在增加。原因主要是特異性問題。第六十四頁，共七十四頁。編輯ppt2、細胞(xìbāo)免疫學(xué)診斷技術(shù)細胞免疫診斷技術(shù)應(yīng)用較少，過去主要應(yīng)用PPD皮試技術(shù)，近年來英國和澳大利亞研制了ELISpot、T-Spot技術(shù)和QFT-Gold。此項技術(shù)用于感染情況的檢測(jiǎncè)是一項特異性較強、靈敏度較高很有希望的新技術(shù)。第六十五頁，共七十四頁。編輯ppt酶聯(lián)免疫斑點(ELISpot)技術(shù)是檢測細胞(xìbāo)分泌細胞(xìbāo)因子的一種實驗方法，采用可定量的夾心ELISA方法，利用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6&CFP-10刺激和激活免疫活性細胞(xìbāo)使其產(chǎn)生IFN-，并檢測IFN-的濃度變化進行診斷的方法。通過ELISpot酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對加底物后形成的斑點分析后得出結(jié)果。ELISpot具有較高的特異性和敏感性。第六十六頁，共七十四頁。編輯pptELISPOT技術(shù)(jìshù)原理細胞免疫主要由T淋巴細胞發(fā)動，T淋巴細胞分成效應(yīng)T淋巴細胞和記憶T淋巴細胞。記憶T淋巴細胞在首次感染病原體后長期存在免疫系統(tǒng)中。當再次受到感染刺激后。這些記憶T淋巴細胞發(fā)出信號分子(fēnzǐ)并增殖成為效應(yīng)T淋巴細胞，效應(yīng)T淋巴細胞分泌細胞因子，如干擾素(INF-γ)。所以無論是否有臨床癥狀，檢測效應(yīng)T淋巴細胞在血中的水平可作為機體是否被感染的指標。第六十七頁，共七十四頁。編輯pptELISPOT在結(jié)核病診斷(zhěnduàn)中的應(yīng)用在MTB潛伏感染診斷中的應(yīng)用早期診斷MTB潛伏感染對控制結(jié)核病意義重大。目前(mùq