生物技術(shù)概論5蛋白質(zhì)工程課件

第五章蛋白質(zhì)工程

第一節(jié)蛋白質(zhì)工程概述一、蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程，就是根據(jù)對(duì)蛋白質(zhì)已知結(jié)構(gòu)和功能的了解，借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，利用基因定點(diǎn)誘變等技術(shù)，特異性地對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行改造，借以改善蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，如提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、酶的專(zhuān)一性等，或者利用化學(xué)和物理手段，對(duì)目標(biāo)基因按預(yù)期設(shè)計(jì)進(jìn)行修飾和改造，合成新的蛋白質(zhì)的技術(shù)手段，并可以借此對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系進(jìn)行更加深入的研究。第五章蛋白質(zhì)工程

二、蛋白質(zhì)概述（一）蛋白質(zhì)的組成組成蛋白質(zhì)分子的化學(xué)元素主要有碳（50%～55%）、氫（6%～7%）、氧（19%～24%）和氮（13%～19%）。組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，其中除甘氨酸和脯氨酸外，均屬于L-α氨基酸，其結(jié)構(gòu)通式如下（R為側(cè)鏈基團(tuán)）（圖5-1）：第五章蛋白質(zhì)工程

（二）蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)第五章蛋白質(zhì)工程

（三）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1.蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系(1)相似的結(jié)構(gòu)具有相似的功能(2)不同結(jié)構(gòu)具有不同的功能2.蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其功能活性也必然會(huì)隨之改變。第五章蛋白質(zhì)工程

第二節(jié)蛋白質(zhì)工程的研究方法一、蛋白質(zhì)工程的研究策略蛋白質(zhì)工程的研究過(guò)程就是在對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的“結(jié)構(gòu)功能”關(guān)系深入理解的基礎(chǔ)上，通過(guò)嚴(yán)格的分子設(shè)計(jì)，把它定向地改造成一個(gè)具有預(yù)期的新的特性的蛋白質(zhì)。這類(lèi)研究中一般有兩種情況：一種是對(duì)天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造；另一種是完全重建一個(gè)自然界原來(lái)沒(méi)有的新的蛋白質(zhì)。第五章蛋白質(zhì)工程

二、改變現(xiàn)有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)目前，蛋白質(zhì)工程側(cè)重于改造現(xiàn)有的蛋白質(zhì)這一領(lǐng)域，主要通過(guò)“小改”和“中改”技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。（一）小改——少數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基的替換小改是指對(duì)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行少數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基的替換。定點(diǎn)突變是目前蛋白質(zhì)工程研究的主要技術(shù)手段。（二）中改——分子剪裁分子剪裁是指在對(duì)天然蛋白質(zhì)的改造中替換一個(gè)肽段或一個(gè)結(jié)構(gòu)域。第五章蛋白質(zhì)工程

三、蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)對(duì)蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)所應(yīng)用的技術(shù)手段是我們前面所提到的“大改”或“從頭設(shè)計(jì)”工作。從頭設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)是在人們認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)、掌握其結(jié)構(gòu)規(guī)律并了解其結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。同時(shí)它也是人們更加深入、全面認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的一個(gè)過(guò)程，它的目的是人工創(chuàng)造出自然界中不存在的蛋白質(zhì)分子，使之具有人們所需要的特殊結(jié)構(gòu)和功能，為人類(lèi)所利用。目前該技術(shù)仍處于實(shí)驗(yàn)初級(jí)階段。第五章蛋白質(zhì)工程

第三節(jié)蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例一、胰蛋白酶胰蛋白酶（EC3.4.21.4）是絲氨酸蛋白酶類(lèi)，它是一條單鏈肽，由223個(gè)氨基酸殘基組成，N末端為異亮氨酸。它主要作用于精氨酸或賴(lài)氨酸羧基端的肽鍵。是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。第五章蛋白質(zhì)工程

胰蛋白酶極易自溶，自溶產(chǎn)物經(jīng)層析分離后，會(huì)得到4個(gè)具有胰蛋白酶活性的片段。通過(guò)對(duì)N末端殘基的分析，表明這些活性產(chǎn)物是由于Arg117-Val118、Lys145-Ser146及Lys159-Ala160處發(fā)生了斷裂而出現(xiàn)的。人們運(yùn)用了蛋白質(zhì)工程手段，對(duì)Arg117位自溶點(diǎn)進(jìn)行了缺失突變，最終得到了穩(wěn)定性明顯提高的突變株。第五章蛋白質(zhì)工程

二、金屬硫蛋白金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是由微生物和植物產(chǎn)生的金屬結(jié)合蛋白，是一類(lèi)富含半胱氨酸的短肽，是半胱氨酸殘基和金屬含量極高的蛋白質(zhì)，可以通過(guò)半胱氨酸的巰基結(jié)合大量的金屬元素，對(duì)多種重金屬有高度的親和性。一般由兩個(gè)大小相近、結(jié)構(gòu)與功能類(lèi)似的結(jié)構(gòu)域組成，即α-結(jié)構(gòu)域和β-結(jié)構(gòu)域。人們?yōu)榱嗽谕寥乐懈患亟饘僭?，并提高植物?duì)重金屬的抗性，便將含有α-結(jié)構(gòu)域的基因轉(zhuǎn)移到煙草中，成功地獲得了對(duì)鎘、銅、鉛等重金屬具有較高抗性的工程株。第五章蛋白質(zhì)工程

三、人白細(xì)胞介素-2IL-2是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素。天然人白細(xì)胞介素-2是一個(gè)由133個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，133個(gè)氨基酸中共有3個(gè)半胱氨酸，其中有一個(gè)半胱氨酸（Cys125）以游離方式存在，而另兩個(gè)半胱氨酸（Cys58和Cys105）縮合成活性所必需的二硫鍵。第五章蛋白質(zhì)工程

人們用蛋白質(zhì)工程中的定位誘變技術(shù)將Cys125的密碼TGT轉(zhuǎn)換成TCT或GCA，使Cys125轉(zhuǎn)換成絲氨酸或丙氨酸，避免了錯(cuò)誤配對(duì)的產(chǎn)生。結(jié)果不但使IL-2的生物活性不受影響，而且其熱穩(wěn)定性等方面也得到了較明顯的改善。工程IL-2目前已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，用于治療腎細(xì)胞瘤。我國(guó)衛(wèi)生部也已經(jīng)批準(zhǔn)了在國(guó)內(nèi)試生產(chǎn)基因工程白細(xì)胞介素-2。第五章蛋白質(zhì)工程

四、組織纖維蛋白溶酶原激活因子tPA能夠切割纖溶酶原形成纖溶酶，從而激活纖溶作用(fibrino1ysis)，使血栓溶解。作為一種高效特異性溶血栓藥物。優(yōu)點(diǎn):(1)血栓選擇性高但幾乎不激活循環(huán)血液中的纖溶系統(tǒng)，可直接靜脈注射；(2)對(duì)中毒性休克引起的彌散性血管內(nèi)凝血療效顯著等。第五章蛋白質(zhì)工程

利用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)，改變tPA分子中的某些糖基化氨基酸而減少或避免了糖基化，有效地減緩了它在血漿中被清除的速率，達(dá)到了延長(zhǎng)其半壽期的目的，臨床應(yīng)用價(jià)值得到有效提高。第五章蛋白質(zhì)工程

五、枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)是由枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)合成的一種絲氨酸蛋白酶?？莶輻U菌蛋白酶根據(jù)來(lái)源的不同可分為Carlsberg、E、BL、YaB等多種。枯草桿菌蛋白酶可以催化蛋白質(zhì)，把蛋白質(zhì)水解成氨基酸。具有重要的應(yīng)用價(jià)值，被廣泛應(yīng)用在洗滌劑、制革及絲綢工業(yè)中，是一種重要的工業(yè)用酶。三維結(jié)構(gòu)及編碼基因目前已經(jīng)基本搞清楚，而且配有合適的克隆、表達(dá)系統(tǒng)以及準(zhǔn)確的定量分析催化活性的方法，因此缺點(diǎn)目前已經(jīng)可以通過(guò)蛋白質(zhì)工程得到改進(jìn)。第五章蛋白質(zhì)工程

對(duì)枯草桿菌蛋白酶所做的定點(diǎn)誘變已有400多個(gè)，在理論和應(yīng)用方面均取得了相當(dāng)大的進(jìn)展和成功?？莶輻U菌蛋白酶早在幾十年前就被開(kāi)發(fā)成為商用的紡織品洗滌劑的添加酶，目前仍然是最基本、最重要，也是使用最廣泛、最成熟的洗滌用酶。應(yīng)用定點(diǎn)改造后的枯草桿菌蛋白酶制成的洗滌劑，便可以實(shí)現(xiàn)與漂白劑共同使用的目的了。另一方面枯草桿菌蛋白酶在作為蛋白質(zhì)工程的研究對(duì)象過(guò)程中，不僅僅使它自身的諸多性能得到了改善；更為重要的是在研究它的過(guò)程中，蛋白質(zhì)工程的研究理論同時(shí)也得到了大大的豐富，這為蛋白質(zhì)工程技術(shù)應(yīng)用于其他酶的研究，尤其是對(duì)其他工業(yè)酶的性能改造提供了非常珍貴的范例和理論指導(dǎo)。第五章蛋白質(zhì)工程