薄層色譜方法課件

薄層色譜法(TLC)一、薄層色譜法的概述（一）平面色譜法的概念

平面色譜法是將固定相涂布于平面載板上，流動相借毛細管作用流經固定相，使被分離后的物質保留在固定相上的一種色譜方法。

薄層色譜法是將被分離物質點在將固定相均勻涂布于玻璃板、鋁箔或塑料片上形成的薄層上而進行分離的。紙色譜薄層色譜平面色譜薄層色譜高效液相色譜色譜系統(tǒng)開放式閉路展開方式展開洗脫流速控制吸附劑的毛細管作用由泵調節(jié)平衡時間短不定分析樣品可同時分析多個樣品每次一個樣品樣品量高低板高（μm）302~5有效板數<600~5000檢測方式靜態(tài)動態(tài)溶劑用量少多溶劑更換易難固定相一次棄去反復使用（二）薄層色譜與高效液相色譜的比較二、薄層色譜法的技術參數薄層色譜保留值表示方式有：比移值（Rf)

比移值是溶質移動距離與流動相移動距離之比，是薄層色譜的基本定性參數。薄層色譜法的技術參數包括分配系數與容量因子，理論塔板數與塔板高度，分離度，保留值等。

當Rf=0時，表示組分留在原點未被展開；當Rf=1時，表示組分隨展開劑至前沿，即組分不被固定相吸附，所以Rf值只能在0~1之間。通常Rf值在0.2~0.8之間較適宜。高比移值（hRf=100×Rf）三、薄層色譜法的基本操作薄層板的準備點樣展開定位定性與定量樣品處理

鋪制薄層板可用的固定相有：硅膠、氧化鋁、纖維素、聚酰胺、葡聚糖凝膠等，其中薄層色譜法用的固定相90%以上的分離工作都可用硅膠。

為了使薄層牢固地附著在支持體上便于操作，需要時還要在固定相中加入合適的粘合劑；為了特殊的分離或檢出需要，有時也需在固定相中加入某些添加劑。（一）薄層板制備薄層板的載板包括有：玻璃板、塑料片和鋁箔。（1）硅膠普通硅膠和改性硅膠兩種類型。1、固定相普通硅膠

硅膠為多孔性無定形粉末，表面有硅醇基成弱酸性（pH=4.5)，通過硅原子上的-OH基與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵而表現其吸附性能。有效的硅醇基數目越多，其吸附能力越強。改性硅膠改性硅膠是借化學反應的方法，將有機分子以共價鍵連接在硅膠的硅醇基上，因此稱為化學鍵合固定相。按鍵合有機硅烷的官能團分為極性鍵合相及非極性鍵合相。硅膠的分離效率的高低與其粒度、孔徑及表面積等幾何結構有關。鍵合有機分子中含有某種極性基團，和普通硅膠比，吸附活性降低。鍵合相表面都是極性很小的烴基，最常用的就是十八烷基鍵合硅膠。（2）氧化鋁

用氧化鋁可分離萜類、生物堿類、脂肪類及芳香族化合物，因制備方法和處理方法的差別，氧化鋁有弱堿性（pH=9~10)、酸性(pH=4~5)及中性(pH=7~7.5)之分，因此其使用范圍也有所不同。

它在薄層色譜法中的應用范圍僅次于硅膠。（3）其他固定相纖維素

按其用途不同分為普通纖維素（天然纖維素、高純度纖維素、微晶纖維素）、乙?；w維素和離子交換纖維素。另外還包括聚酰胺，葡聚糖凝膠（親水性葡聚糖凝膠、親脂性葡聚糖凝膠和葡聚糖凝膠離子交換劑）和硅藻土等固定相。2、粘合劑及添加劑（1）粘合劑理想的粘合劑要求親水性好、粘結力強且具有化學惰性。常用粘合劑有：煅石膏(CaSO4)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、淀粉；預制板的粘合劑包括有聚乙烯醇、聚丙烯醇或聚丙烯酰胺等高聚物。（2）添加劑

為了特殊需要可在制備薄層時加入某些添加劑制備成具有特殊性能的薄層。包括有熒光指示劑，酸、堿或緩沖液，硝酸銀溶液和其他。

帶有熒光指示劑的薄層在紫外燈下整個薄層呈現熒光，被分離化合物的斑點處的熒光被猝滅而呈暗色。吸附劑及預制板包裝上部分符號及含義符號含義G以石膏作粘合劑

H無外加粘合劑

R特別純化的P制備用W水可濕性的Ｆ254,365

熒光指示劑激發(fā)波長

F254s抗酸性熒光指示劑40,60,….平均孔徑3、薄層板的制備方法薄層板包括有預制板和手工制板兩種。（1）預制板

預制板使用方便，涂布均勻，薄層光滑及有很好的牢度，預制板有用玻璃板，塑料片或鋁箔作為載板，使薄層附著在上面，塑料片或鋁箔的預制板還有裁剪方便的優(yōu)點。常用于薄層定量。（2）手工制板

手工制板一般分為不含粘合劑的軟板及含粘合劑的硬板兩種。手工制板所用的玻璃板一般為5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的2mm厚的玻璃板，要求板面平整，洗凈后排列在薄層板放置架上備用。軟板是將吸附劑直接于玻璃板上用干法涂成均勻的薄層即可使用，但軟板疏松，操作不方便，因此目前很少使用，主要用硬板。

洗凈的玻璃板用乙醇擦拭干凈，揮干乙醇后，用手動或自動涂布器（最好用自動涂布器）將已調制好的固定相均勻地涂鋪在玻璃板上，涂布后的薄層板應水平放置，室溫陰干備用。制備薄層板時的注意事項（1）必須先要制備固定相勻漿，由于固定相及粘合劑類型不同，性能也不同，勻漿時加水量也不同。勻漿攪拌時應朝同一個方向進行，以減少氣泡的產生。（2）涂布時速度要快，避免固定相過度凝固給涂布帶來困難，涂布速度要求均勻，涂布后的薄層晾干時應在陰涼的地方，避免因通風而導致層面產生裂紋；應保持水平放置。（3）定性定量時用的薄層固定相厚度為0.2~0.3mm，制備薄層的厚度要求約0.5~2mm。4、薄層板的活化手工制的硅膠或氧化鋁薄層板，涂布晾干后有時必須經過活化才能使用。薄層分離物質與吸附劑表面及其孔隙表面的活性點的強度和數目有關?；钚渣c的強度及數目較大時，吸附劑的活度就高，吸附劑的保留能力也較高，不同物質在吸附劑上被吸附的能力不同，則可以彼此分離。薄層板活化的原因薄層活度大小受大氣相對濕度的影響，吸附劑表面能可逆地吸收水分。如果大氣濕度過大，薄層活度過低，對分離效果會產生影響。

為了提高薄層活度則必須將室溫晾干的薄層板在點樣前根據活度要求在一定溫度下活化。一般晾干后的薄層板在105~120℃條件下干燥0.5~1h。（二）點樣在點樣前，應將薄層板在日光或紫外光下檢查板面有無損壞或污染。

點樣時通常使用點樣針和毛細管進行點樣。毛細管規(guī)格(mm)：內徑Φ0.1、0.2、0.3、0.4、0.5×長度100。注意：點樣時點樣針或毛細管不能劃破載板上的固定相。點狀點樣：原點直徑<5mm，一般為3mm（經典薄層）和1~2mm（高效薄層）。帶狀點樣：展開后的斑點不僅分辨率明顯高于點狀點樣，而且精密準確，為定量分析提供最佳條件。

常用的點樣方式：點狀點樣和帶狀點樣。1.原點直徑過大會降低分辨率及分離度；盡可能避免多次點樣。2.點樣量：經典薄層一般為1~5ul，高效薄層為100~500nl，總量不要超載。3.點樣速度盡可能快，耗時盡可能短。注意：

硅膠的硅醇基以氫鍵的形式優(yōu)先吸附水，吸水速度很快，因此應用預先經過活化的薄層板。在點樣時也會立即吸附空氣中的水蒸氣，因此在點樣時可用干凈的玻璃板蓋住活化的薄層板，只留出原點區(qū)域以便點樣。幾種不同點樣方式的比較A.長5~60mm，內徑為0.2~0.05mm的熔融石英管；B.微量注射器，機械控制，接觸板面點樣；C.同B，用步進馬達控制操作；D.同B，完全用計算機控制點樣。ABCD方式優(yōu)點缺點A價廉精密度差B很精密需要儀器C很精密儀器復雜D很精密儀器很復雜（三）展開點樣后的薄層需置密閉并加有展開劑的展開室中進行展開，樣品與展開劑及固定相之間相互作用的結果使樣品中各成分沿展開劑流動的方向被分開。1、展開室雙槽展開室平底展開室平面色譜的展開有三種幾何形式即線性、環(huán)形及向心。其中最常用的有線性展開和多次展開。（a）、（b）為線性，（c）為環(huán)形，（d）為向心2、展開方式線性展開：上行展開、下行展開、雙向展開、近水平展開、水平展開。近水平展開上行展開溶劑蒸發(fā)面積大，展開時易飽和展開速度快展開溶劑用量大溶劑易浸沒點樣點3、展開劑展開劑又可稱為溶劑系統(tǒng)、流動相或洗脫劑，是在平面色譜法中用作流動相的液體。理想的展開劑分離樣品得到的Rf值應在0.2~0.8之間。（1）溶劑的分類展開劑是由單一或混合溶劑組成的，因此溶劑的性質是溶劑分類的基礎，溶劑分類是確定展開劑組成的基礎。溶劑分成6類：第Ⅰ類為電子授受體溶劑；第Ⅱ類為質子給予體溶劑；第Ⅲ類為強質子給予體溶劑；第Ⅳ類為質子受體溶劑；第Ⅴ類為偶極作用力溶劑；第Ⅵ類為惰性溶劑（即非極性溶劑）。（2）溶劑強度

溶劑強度是指單一溶劑或混合溶劑洗脫某種溶質的能力。在正相色譜中，它隨溶劑極性的增加而增大；在反相色譜中則相反。溶劑強度大的溶劑洗脫能力強。

常用溶劑洗脫順序（由弱到強）：四氯化碳（1.7），甲苯（2.3），氯仿（4.4），乙腈（6.2），乙酸乙酯（4.3），丙酮（5.4），乙醇（5.2），甲醇（6.6），水（9.0）。展開劑的選擇方法：三角形法。根據展開劑、固定相及被分離物質三者間的相互影響，三者的關系如下：極性展開劑非極性親水性樣品親脂性固定相失活性活性展開劑選擇的步驟：薄層展開時展開劑的量不能太少也不能太多，太少被分離物質不能分離，太多則會淹沒點樣點，使被分離物從薄層板上脫離而溶于展開劑中。第二：進一步提高展開劑的選擇性，即使樣品中各組分有合適的分離度。對于未知混合物，則要求分離斑點數越多越好。第一：選擇一種合適的溶劑強度的展開劑，使樣品中各組分多落在最佳或至少是可用Rf范圍內。4、影響薄層展開的因素（1）相對濕度的影響

水蒸氣與吸附劑之間有很大的親和力，即使是微量的水蒸氣對色譜分離結果也會產生較大的影響。（2）溶劑蒸氣的影響平面色譜分離過程是固定相、流動相和氣相共同作用的結果。在展開時展開室的飽和對分離有明顯的影響。溶劑蒸氣得不到飽和易引起“邊緣效應”。

產生邊緣效應時，只需用展開劑將展開室及薄層板飽和后再展開就可以消除。

飽和對展開影響很大，因此對展開室的飽和及對薄層的預平衡非常重要。此外，展開時展開室的密閉也很重要。（3）溫度的影響

展開時環(huán)境的溫度對薄層色譜的展開影響很小。通常在室溫下進行展開。（4）展開方式的影響不同的展開方式，不同的展開條件對平面色譜的分離效果有明顯的影響。（5）展距的影響常規(guī)薄層展距為10~20cm，高效薄層為5~10cm。（6）展開室的放置

不能放在空氣對流強的地方，并且注意避光。（四）定位展開后的薄層板需揮干表面多余的展開劑，然后采用適當的方法對被分離物質進行定位。1、光學檢出法

化合物對可見光和紫外光有吸收，在色譜上可觀察到不同顏色的斑點；對可見光和紫外光都不吸收，也沒有合適的顯色方法的化合物可以用熒光猝滅技術進行檢測。定位方法光學檢出法的使用范圍：

光學檢出法使用方便，被檢出物質不被破壞，適用于雙向展開，多次展開等的定位，也宜應用于洗脫定量時定位，是平面色譜定位的首選方法。2、蒸氣檢出法（1）利用一些物質的蒸氣與樣品作用生產不同顏色或產生熒光。此法不會改變化合物性質，靈敏度高，是薄層定位常用的簡便方法。（2）另一些化合物，當薄層放置在碘蒸氣中幾秒鐘后，就立即產生不可逆的化學反應。此法常用于薄層的定位與定性。但要注意有些化合物與碘蒸氣發(fā)生不可逆反應而改變原來化合物的性質。3、試劑顯色法

分離后的化合物在紫外光或可見光下不能顯示斑點，可根據被檢出化合物的理化性質選擇適當的顯色劑使之生成顏色或熒光穩(wěn)定、輪廓清楚、靈敏度高、專屬性強的斑點。

這種方法是通過一種或幾種試劑與被檢物質產生化學反應，生成有色物質，是平面色譜廣泛應用的定位方法。噴霧顯色的顯色劑溶液以氣溶膠的形式均勻的噴灑在薄層上。（1）顯色方法：噴霧顯色、浸漬顯色、超壓衍生化等。噴霧顯色法務必在通風柜中進行。

自動噴霧器適用于定量。手動噴霧器用于定量分析時可能因噴霧不均勻而產生較大誤差。（2）顯色試劑

顯色試劑有通用顯色劑和專屬性顯色劑。①通用顯色劑a.硫酸

噴后110℃烤15min，不同有機化合物顯不同顏色。b.0.5%碘的氯仿溶液

對很多化合物顯黃棕色。c.中性0.05%高錳酸鉀溶液

易還原性化合物在淡紅背景上顯黃色。d.堿性高錳酸鉀試劑

還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色。e.酸性高錳酸鉀試劑

噴1.6%高錳酸鉀濃硫酸溶液（溶解時注意防止爆炸），噴后薄層于180℃加熱15~20min。

f.酸性重鉻酸鉀試劑

噴5%重鉻酸鉀濃硫酸溶液，必要時150℃烤薄層。g.5%磷鉬酸乙醇溶液

噴后120℃烘烤，還原性化合物顯藍色，再用氨氣薰，則背景變?yōu)闊o色。h.鐵氰化鉀-三氯化鐵試劑

還原性物質顯藍色，再噴2mol/L鹽酸溶液，藍色加深。a.甲醛/硫酸檢出物：多環(huán)芳烴b.茚三酮檢出物：氨基酸、胺與氨基糖類。方法：噴后于110℃加熱。結果：呈紅紫色斑點。c.鄰氨基聯苯/磷酸檢出物：糖類方法：噴板后110℃加熱15~20min.結果：斑點呈褐色。②專屬性顯色劑d.甲基黃

檢出物：氯化殺蟲劑及抗菌化合物。

方法：噴板后于室溫干燥，并在無濾光片紫外光下照射5min。

結果：黃色背景上呈紅色斑點。

e.溴/四氯化碳

檢出物：有機磷殺蟲劑。

方法：薰溴蒸氣。

f.三氯化鋁

檢出物：黃酮類。

方法：噴板。

結果：紫外光長波下顯黃色熒光。（五）定性與定量（1）斑點的Rf值經過兩種以上不同組成的展開劑展開后得到的Rf值均與隨行對照品一致時，才可確定該斑點與隨行對照品是同一化合物。1、定性（2）斑點的顯色特性

在自然光或紫外光或