血紅蛋白的提取和分離(經典)

4、基本組成單位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸連接方式脫水縮合寫出氨基酸脫水縮合形成二肽示意圖當前第1頁\共有90頁\編于星期四\12點氨基酸的結合方式CHCOOHR1CHNH2COOHR2NH2COHNHOH當前第2頁\共有90頁\編于星期四\12點氨基酸的結合方式CHR1NH2OHCOH2OCHCOOHR2HNH當前第3頁\共有90頁\編于星期四\12點氨基酸的結合方式:CHR1NH2COCHCOOHR2HNH2O二肽肽鍵脫水縮合當前第4頁\共有90頁\編于星期四\12點氨基酸的結合方式:脫水縮合肽鍵CHCOOHR3HNOHHCCHR1NH2COCHR2HNO二肽H2OH2O當前第5頁\共有90頁\編于星期四\12點氨基酸的結合方式:脫水縮合CCHR1NH2COCHR2HNO肽鍵二肽CHCOOHR3HNH2O肽鍵三肽以此類推，由多個氨基酸分子縮合而成的含有多個肽鍵的化合物，叫多肽（鏈狀）。肽鏈盤曲，折疊，形成有一定空間結構的蛋白質分子。H2O當前第6頁\共有90頁\編于星期四\12點8、分子結構7、肽鍵CONH氨基酸肽鏈蛋白質脫水縮合盤曲折疊（一條或者多條）當前第7頁\共有90頁\編于星期四\12點10、生理功能細胞和生物體的結構物質，是人體發(fā)育和組織更新的主要原料，具有運輸、調節(jié)、免疫、催化等作用，是一切生命活動的主要承擔者氨基酸的種類不同；數目成百上千；排列順序變化多端；多肽鏈的空間結構千差萬別9、蛋白質結構的多樣性當前第8頁\共有90頁\編于星期四\12點①氨基酸間脫水縮合時，原來的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一個氨基，另一端只有一個羧基（不計R基上的氨基和羧基）。所以對于一條多肽鏈說，至少應有的氨基和羧基都是一個②若有個n氨基酸分子縮和成m條肽鏈,則可形成________個肽鍵,脫去______個水分子，至有氨基和羧基各____個11、相關計算n-mn-mm當前第9頁\共有90頁\編于星期四\12點③蛋白質可以含有一條或n條肽鏈、肽鏈通過化學鍵（如二硫鍵）互相連接，具有不同的空間結構當前第10頁\共有90頁\編于星期四\12點當前第11頁\共有90頁\編于星期四\12點④關于蛋白質相對分子量的計算：n個氨基酸形成m條肽鏈，每個氨基酸的平均相對質量為a,那么由此形成的蛋白質的相對分子量為______________n·a-(n-m)·18當前第12頁\共有90頁\編于星期四\12點當前第13頁\共有90頁\編于星期四\12點血紅蛋白當前第14頁\共有90頁\編于星期四\12點思考1

高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質的何種作用，作用結果是什么被破壞？變性、變性、空間結構思考2

人們用雞的紅細胞提取DNA，用人的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提取，人的紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。當前第15頁\共有90頁\編于星期四\12點本課題學習目標

體驗從復雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝膠色譜法②電泳法③緩沖溶液④它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。2、主要原理：①凝膠色譜法分離蛋白質的原理②電泳法分離樣品的原理③緩沖溶液的組成和作用機理3、課題重點：凝膠色譜法的原理和方法4、課題難點：

①樣品的處理②色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。當前第16頁\共有90頁\編于星期四\12點

1、凝膠色譜法凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據分子量的大小分離蛋白質的方法之一，又稱分子篩層析。凝膠實際上是一些微小的多孔球體，例如：浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等一、基本概念及原理當前第17頁\共有90頁\編于星期四\12點原理：當不同的蛋白質通過凝膠時相對分子質量較小相對分子質量較大凝膠內部的通道容易進入無法進入凝膠內部的通道只能在凝膠外部移動路程較長移動速度較慢路程較短移動速度較快相對分子質量不同的蛋白質因此得以分離。當前第18頁\共有90頁\編于星期四\12點4.凝膠色譜法分離蛋白質的原理和具體過程當前第19頁\共有90頁\編于星期四\12點凝膠色譜法分離蛋白質過程的動畫演示

當前第20頁\共有90頁\編于星期四\12點當前第21頁\共有90頁\編于星期四\12點二、緩沖溶液

在一定范圍內，能夠抵制

對溶液PH值的影響，維持PH

不變。1.作用:2.配制:

通常由

溶解于水中配制而成。調節(jié)緩沖劑

的就可以制得在

使用的緩沖液。3.提問：在本課題中使用的緩沖液是:__________,其目的是:

利用緩沖液模擬細胞內的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察(紅色)和科學研究(活性)磷酸緩沖液外界的酸和堿基本1~2種緩沖劑使用比例不同PH范圍內思考：說出人體血液中緩沖對。

NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3當前第22頁\共有90頁\編于星期四\12點三、電泳血紅蛋白的分離鑒定方法1.概念：帶電粒子在

作用下發(fā)生

的過程。2.原理：

許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有

的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上

或

。在電場的作用下，這些帶電分子會向著的

的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子

以及分子本身的

、

的不同，使帶電分子產生不同的

，從而實現樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。電場遷移可解離正電負電與其所帶電荷相反帶電性質的差異大小形狀遷移速度當前第23頁\共有90頁\編于星期四\12點

最常用的電泳支持介質是聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠。瓊脂糖有一個相對較大的孔徑，用來分離大分子例如核酸、大蛋白和蛋白復合物，聚丙烯酰胺形成孔徑較小的膠，適合于分離大多數蛋白和小片段核酸。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）當前第24頁\共有90頁\編于星期四\12點

在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動瓊脂糖凝膠電泳示意圖當前第25頁\共有90頁\編于星期四\12點迷你雙垂直電泳槽等電聚焦多用電泳槽臥式電泳槽電泳槽9當前第26頁\共有90頁\編于星期四\12點

（1）、蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于

等因素。它所帶靜電荷的多少以及分子的大?。?）、SDS能與各種蛋白質形成蛋白質-SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于（）。分子的大小SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）當前第27頁\共有90頁\編于星期四\12點聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

（A為正面，B為剖面）

1：樣品膠pH6.72：濃縮膠pH6.7

3：分離膠pH8.9

4：電極緩沖液pH8.310當前第28頁\共有90頁\編于星期四\12點①瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需要事先處理；電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。②測定蛋白質的相對分子質量常用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，這是因為該方法分離蛋白質完全取決于分子的大小，而非所帶電荷的性質和分子的大小、形狀。當前第29頁\共有90頁\編于星期四\12點【典例1】有關凝膠色譜法和電泳法的說法正確的是A.它們都是分離蛋白質的重要方法B.它們的原理相同C.使用凝膠色譜法需要使用緩沖溶液而電泳不需要D.以上說法都正確

【解題關鍵】解答本題的關鍵應明確以下兩點：(1)凝膠色譜法的原理；(2)電泳法的原理。A當前第30頁\共有90頁\編于星期四\12點二、實驗步驟蛋白質的提取和分離一般分為四步：樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定（電泳）當前第31頁\共有90頁\編于星期四\12點實驗操作樣品處理（一）蛋白質提取和分離步驟（二）操作過程紅細胞的洗滌粗分離：血紅蛋白的釋放分離血紅蛋白溶液純化：純度鑒定透析—去除樣品中分子量較小的雜質用凝膠色譜法除去相對分子質量較大的雜質SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳當前第32頁\共有90頁\編于星期四\12點血液血漿水分其他物質：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團2.血液有哪些成分？

1.用雞的紅細胞提取DNA，用哺乳動物的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？

雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提??；人的紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白當前第33頁\共有90頁\編于星期四\12點當前第34頁\共有90頁\編于星期四\12點血紅蛋白兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點：當前第35頁\共有90頁\編于星期四\12點采集得到血液（加入抗凝血劑檸檬酸鈉）當前第36頁\共有90頁\編于星期四\12點（1）紅細胞的洗滌A、洗滌目的:B、分離時采用

離心，用

洗滌，重復洗滌

，直至

C、能否用蒸餾水代替生理鹽水？去除雜質血漿蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化低速短時間五倍體積的生理鹽水三次

上清液不再呈現黃色，表明紅細胞已洗滌干凈不能，生理鹽水能保持紅細胞的滲透壓而不至于破裂，若紅細胞提前破裂，使血紅蛋白與雜質血漿蛋白混在一起，加大分離難度。當前第37頁\共有90頁\編于星期四\12點初次離心后的結果3次洗滌后的結果當前第38頁\共有90頁\編于星期四\12點（2）釋放血紅蛋白思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細胞加入了哪些物質？為了加速釋放過程，采取了什么措施？

（使用磁力攪拌器充分攪拌）目的分析：蒸餾水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分攪拌的目的是____________________________。使紅細胞大量吸水脹裂溶解紅細胞的細胞膜加速紅細胞的破裂當前第39頁\共有90頁\編于星期四\12點磁力攪拌器當前第40頁\共有90頁\編于星期四\12點攪拌器轉子當前第41頁\共有90頁\編于星期四\12點攪拌器正在工作當前第42頁\共有90頁\編于星期四\12點（3）分離血紅蛋白溶液：

用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。當前第43頁\共有90頁\編于星期四\12點甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次當前第44頁\共有90頁\編于星期四\12點柜式離心機當前第45頁\共有90頁\編于星期四\12點

2.粗分離透析（去除分子量較小的雜質）（1）用

方法進行粗分離，透析袋由半透膜制成，常用。將透析袋放入

溶液中進行透析。（2）透析的原理是（3）透析的目的是

。

透析玻璃紙、腸衣、膀胱膜

透析袋能使小分子自由進出，而將大分子保留在袋內去除樣品中分子量較小的雜質磷酸緩沖當前第46頁\共有90頁\編于星期四\12點當前第47頁\共有90頁\編于星期四\12點透析過程動畫演示當前第48頁\共有90頁\編于星期四\12點（1）凝膠色譜柱的制作①取長40厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好。

3、純化（凝膠色譜）去除相對分子量較大的雜質蛋白

當前第49頁\共有90頁\編于星期四\12點凝膠色譜柱的制作當前第50頁\共有90頁\編于星期四\12點（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。

②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：

A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。

B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。當前第51頁\共有90頁\編于星期四\12點教材P70：為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？如果裝填不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內形成無效的空隙，使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，影響分離的效果。思考當前第52頁\共有90頁\編于星期四\12點裝配好的凝膠柱當前第53頁\共有90頁\編于星期四\12點(3）樣品加入與洗脫①加樣前打開下端出口，使柱內凝膠面上的（）緩慢下降到與（）平齊，關閉出口緩沖液凝膠面當前第54頁\共有90頁\編于星期四\12點注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。②加透析樣品當前第55頁\共有90頁\編于星期四\12點當前第56頁\共有90頁\編于星期四\12點當前第57頁\共有90頁\編于星期四\12點立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據色譜柱體積計算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計算稱量凝膠固定色譜柱材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75

20mmol/L磷酸緩沖液“G”表示什么？75代表什么？當前第58頁\共有90頁\編于星期四\12點3.樣品的加入和洗脫

1.調液面2.加樣3.再調液面

4.洗脫5.收集緩沖液凝膠當前第59頁\共有90頁\編于星期四\12點①調整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：加到色譜柱的（）③樣品滲入凝膠床：（）④再調整緩沖液面洗脫：⑤收集：待（）接近色譜柱底端時收集頂端樣品完全進凝膠層紅色的蛋白質色譜柱制作成功的標志：紅色區(qū)帶均勻一致的移動記當前第60頁\共有90頁\編于星期四\12點4、純度鑒定（電泳）SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷純化的蛋白質是否達到要求，需要進行蛋白質的鑒定。1、垂直板電泳裝置2、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀；3、微量進樣器（可用微量移液器代替）當前第61頁\共有90頁\編于星期四\12點（1）、膠板的制備：①.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干②.把玻璃板在灌膠支架上固定好當前第62頁\共有90頁\編于星期四\12點

（2）、分離膠的制備：

按下表制備分離膠(T=12%,pH=8.8)試劑雙蒸水分離膠緩沖液丙膠貯液ApTEMED

用量1.65mL1.3mL

2.0mL0.05mL0.002mL

膠灌至距梳子齒下端1cm→灌畢→封上一層水→當膠與水出現清晰界限時表明聚合好。當前第63頁\共有90頁\編于星期四\12點（3）、濃縮膠的制備：按下表制備濃縮膠(T=4%,pH=6.8)試劑雙蒸水濃縮膠緩沖液丙膠貯液ApTEMED用量1.46mL0.25mL 0.27mL0.02mL0.002mL

用濾紙吸干水→倒入濃縮膠→插入梳子→聚合。當前第64頁\共有90頁\編于星期四\12點（4）、取樣

取純化后的血紅蛋白樣品10μL加入10μL上樣buffer（內含少許溴酚藍的40％蔗糖）混勻。當前第65頁\共有90頁\編于星期四\12點（5）裝槽、點樣：

拔出梳子→將膠板固定在電泳槽上（凹板一側向內）→在電泳槽中加入緩沖液→點樣。當前第66頁\共有90頁\編于星期四\12點當前第67頁\共有90頁\編于星期四\12點（6）電泳：當前第68頁\共有90頁\編于星期四\12點（7)、剝膠、染色及脫色

凝膠板剝離：電泳結束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標記后放在大培養(yǎng)皿內，加染色液染色，然后用脫色液脫色。當前第69頁\共有90頁\編于星期四\12點(8)、結果當前第70頁\共有90頁\編于星期四\12點

1、由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風櫥內或通風處進行。

2、TEMED和過硫酸胺對黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。

3、在進行電泳操作時一定按照實驗要求和步驟完成。操作時要戴好一次性手套。注意事項：SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳當前第71頁\共有90頁\編于星期四\12點影響蛋白質分子運動速度的因素√√√√√√√當前第72頁\共有90頁\編于星期四\12點思考下面的問題：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內，維持結構和功能正常。1、在血紅蛋白純化的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？2、與其他蛋白質相比，血紅蛋白有什么特點？這一特點對你進行血紅蛋白的分離有什么啟示？血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。3、你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液（離心）等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經過透析去除分子量較小的雜質，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質量較大的雜質蛋白除去，即:樣品的純化；最后經聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。當前第73頁\共有90頁\編于星期四\12點【典例2】(2011·揚州高二檢測)如圖表示血紅蛋白提取和分離的部分實驗裝置，請回答下列問題：當前第74頁\共有90頁\編于星期四\12點(1)血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細胞的主要組成成分，其在紅細胞中的作用體現了蛋白質具有____________功能。(2)甲裝置中，B是血紅蛋白溶液，則A是____________；乙裝置中，C溶液的作用是_____________________________。(3)甲裝置用于____________，目的是__________________________________。用乙裝置分離蛋白質的方法叫____________，是根據_________________分離蛋白質的有效方法。(4)用乙裝置分離血紅蛋白時，待_____________-_________時，用試管收集流出液，每5mL收集一管，連續(xù)收集。運輸磷酸緩沖液洗脫血紅蛋白透析(粗分離)去除樣品中相對分子質量較小的雜質凝膠色譜法相對分子質量的大小紅色的蛋白質接近色譜柱底端當前第75頁\共有90頁\編于星期四\12點

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實驗結果分析與評價

1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。

當前第76頁\共有90頁\編于星期四\12點

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。

3、你能觀察到蛋白質的分離過程中紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據此判斷分離效果？當前第77頁\共有90頁\編于星期四\12點 教學反饋1．凝膠色譜法是根據（）分離蛋白質的有效方法。A分子的大小B相對分子質量的大小C帶電荷的多少D溶解度2．緩沖液的作用是：在一定范圍內，抵制外界的影響來維持（）基本不變。A溫度BpHC滲透壓D氧氣濃度3．電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移動。A相同B相反C相對D相向4.哺乳動物和人的成熟的紅細胞中的（）與氧氣的運輸有關。A血紅蛋白B肌紅蛋白C肌動蛋白D肌球蛋白BBBA當前第78頁\共有90頁\編于星期四\12點5．血液由血漿和各種血細胞組成，其中（）的含量最多。A白細胞B血小板C紅細胞D淋巴細胞6．為防止血液凝固，在采血容器中要預先加入抗凝血劑（）。A.NaClB.甲苯C.蒸餾水D.檸檬酸鈉7．將攪拌好的混合液轉移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是（）A無色透明的甲苯層B脂溶性物質的沉淀層C血紅蛋白的水溶液D其他雜質的暗紅色沉淀物CDC當前第79頁\共有90頁\編于星期四\12點1、隨著人類跨入蛋白質組時代，對蛋白質的研究和應用越來越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質的空間結構B弄清各種蛋白質的功能C弄清各種蛋白質的合成過程D獲得高純度的蛋白質當前第80頁\共有90頁\編于星期四\12點2、用凝膠色譜法分離蛋白質的過程中，關于蛋白質的敘述，正確的是A相對分子質量較小的蛋白質行程大于相對分子質量較大的蛋白質B相對分子質量較小的蛋白質行程小于相對分子質量較大的蛋白質C相對分子質量較小的蛋白質行程等于相對分子質量較大的蛋白質D二者根本無法比較當前第81頁\共有90頁\編于星期四\12點3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A調節(jié)pHB維持紅細胞的能量供應C防止微生物生長D防止血液凝固當前第82頁\共有90頁\編于星期四\12點6、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序自上而下是：有機溶劑脂類物質血紅蛋白溶液紅細胞破碎物沉淀當前第83頁\共有90頁\編于星期四\12點1.答:凝膠色譜法也稱為分配色譜法,它是根據分子量的大小分離蛋白質的方法之一.所用的凝膠實際上是一些微小的多孔球體,這些小球體大多數是由多糖類化合物構成,小球體內部有許多貫穿的通道,當一個含有各種分子的樣品溶液緩慢流經時,各分子在色譜柱內進行兩種不同的運動,即垂直向下的運動和無規(guī)則的擴散運動.相對分子質量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒內部,只能分布在顆粒之間,通過的路程較短,移動速度較快;相對分子質量較小的蛋白質分子比較容易進入凝膠內的通道,通過的路程較長,移動速度較慢.因此,樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出,相對分子質量中等的分子后流出,相對分子質量最小的分子最后流出,這種現象又叫分子篩現象.1.凝膠色譜法分離蛋白質的的原理是怎樣的?課后練習當前第84頁\共有90頁\編于星期四\12點答:在一定范圍內,能對抗外來少量強酸,強堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用,具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液.緩沖溶液通常是由一或兩種緩沖劑溶解于水中制得,調節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液.

緩沖溶液的作用維持反應體系的pH不變.在生物體內進行的各種生物化學過程都是在精確的pH下進行的,受到氫離子濃度的嚴格調控.為了在實驗室條件下準確地模擬生物體內的天然環(huán)境,就必須保持體外生物化學反應過程有與體內過程完全相同的pH.

2.什么是緩沖溶液?它的作用是什么?當前第85頁\共有90頁\編于星期四\12點原理：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程.許多重要的生物大分子,如氨基酸,多肽,蛋白質,核苷酸,核酸等都具有可解離基團,它們在某個特定的pH下會帶上正電或負電;在電場的作用下,這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向移動.作用：電泳技術就是在電場的作用下,利用待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小,形狀等性質的差異,使帶電分子產生不同的遷移速度,從而達到對樣品進行分離,鑒定或提純的目的.

3.電泳的作用及其原理是什么?當前第86頁\共有90頁\編于星期四\12點答:血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步,包括:樣品處理,粗分離,純化和純度鑒定.首先通過洗滌紅細胞,血紅蛋白的釋放,離心等操作收集到血紅蛋白溶液,即樣品的處理;再經過透析去除分子量較小的雜質,即樣品的粗分離;然后通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去,即樣品的純化;最后經聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定.

答:血紅蛋白是有色蛋白,因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液.這使血紅蛋白的分離過程非常直觀,大大簡化了實驗操作.

4.你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎?5.與其他真核細胞相比,紅細胞有什么特點?這一特點對你進行蛋白質的分離有什么意義?當前第87頁\共有90頁\編于星期四\12點3、SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳：2.試劑的配制：鑒定血紅蛋白純度。1.目的：

①丙烯酰胺和N,N-亞甲基雙丙烯酰胺:

用去離子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的貯存液。②十二烷基硫酸鈉（SDS）:

用去離子水配成10%的貯存液，于室溫保存。③用于制備分離膠和濃縮膠的Tris緩沖液。④TEMED：作用通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。⑤用去離子水配制10%過硫酸銨：作用是提供驅動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮液。⑥Tris—甘氨酸電泳緩沖